精浆Na+-K+-ATP酶及降钙素基因相关肽与男性精子质量相关研究

黄　群，梁朝荣，韦高猛，孟冬冬

(右江民族医学院附属医院泌尿外科，百色 533000)

HUANG Qun,LIANG Chaorong,WEI Gaomeng,MENG Dongdong

(Department of Urology,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,China)



论著

精浆Na+-K+-ATP酶及降钙素基因相关肽与男性精子质量相关研究

黄群，梁朝荣，韦高猛，孟冬冬

(右江民族医学院附属医院泌尿外科，百色 533000)

【摘要】目的探讨精浆Na+-K+-ATP酶、降钙素基因相关肽(CGRP)与男性精子质量的相关性。方法参照第5版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》标准，将研究对象分为无精子症组、少精子症组、少弱精子症组、弱精子症组、死精子症组及正常对照组，通过双抗体夹心法检测精浆中Na+-K+-ATP酶及CGRP的浓度，研究精浆中Na+-K+-ATP酶及CGRP与男性精子质量的相关性。结果比较不同精液质量组(无精子组、少精子组、少弱精子组、弱精子组、死精子组)间精浆中Na+-K+-ATP酶的浓度差异均无统计学意义(P>0.05)。比较不同精液质量组间精浆中CGRP的浓度差异均无统计学意义(P>0.05)。结论精浆中Na+-K+-ATP酶的浓度及降钙素基因相关肽的浓度与精子质量可能均无相关性。

【关键词】精浆Na+-K+-ATP酶；降钙素基因相关肽；精子质量

在男性不育的病因中，以精子质量下降占首要。Ca2+是细胞内精子能动性的重要调节因子，低浓度的Ca2+可促进精子的能动性，相反高浓度Ca2+降低精子的能动性。降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptid,CGRP)[1]是应用DNA基因重组和分子生物技术研究发现的。有关研究表明CGRP能维持细胞Ca2+稳定，降低细胞膜对Ca2+的通透性，从而影响细胞内外钙离子的浓度水平，具有调节血流和胃肠运动功能的作用[2]。精子质膜上存在Ca2+-ATP酶和Na+/Ca2+交换系统，调节细胞内钙离子浓度[3]。Na+-Ca2+交换体转运离子的动力来源于Na+-K+-ATP酶转运带来的膜两侧Na+的浓度差。为了解Na+-K+-ATP酶、CGRP与精子质量间的关系，我们对不同精子质量的精浆中的Na+-K+-ATP ase和CGRP进行研究，探讨其间的相关性。

1对象与方法

1.1研究对象从2014年1～9月期间因不育症(夫妻结婚后同居1年以上，有规律性生活，未采取任何避孕措施，因男方因素造成女方不孕者)来我院就诊的男性患者中随机选取无精症17例、少精症18例、少弱精症30例、弱精症55例、死精症26例作为病例组。排除睾丸、附睾、输精管的异常及遗传性、血管性、恶病质等疾病导致的继发性不育患者。另外选择具有正常生育史，身体健康，性生活及精液检查均正常的34例男性作为正常对照组。研究对象均在知情情况下自愿参与该实验研究。

1.2分组标准以WHO的标准进行分组：(1)正常精液：精液量1.5～6 ml,pH 7.2～8.0，液化时间<60 min，精子密度≥15×106/ml，精子活力a+b级比例≥32%或a+b+c级比例≥40%；(2)无精子症的标准为：经离心沉淀精液中未见精子；(3)少精子症的标准为：精子密度<15×106/ml且>0；(4)弱精子症的标准：精子活力a+b级比例<32%或a+b+c级比例<40%；(5)少弱精子症的标准：少精子且弱精子症；(6)死精子症：无活精子，全为死精子。

1.3实验方法

1.3.1仪器及试剂CGRP酶及人ATP酶酶联免疫分析试剂盒(生产商U.S.A TSZ biological trade Co.Ltd)、计算机辅助精液分析系统、光学显微镜、微型离心机、酶标仪(芬兰仪器型号352型)。

1.3.2精液标本的收集依照第5版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》的标准规定进行操作，在留取精液前所有研究对象均禁欲3～7 天，作息饮食正常，在本院以手淫法收取精液标本于专用的取精杯中。随后精液标本将放置于恒温为37℃水浴箱中，待精液完全液化后，先在光学显微镜下常规观察分析，然后取2 ml精液量进行计算机辅助精液分析。将余下精液用微型高速离心机以3000×g速度离心15 min后分离出精浆、精子，留取精浆(光学显微镜下观察内无精子)收集于EP管中冷冻于-80℃冰箱待统一检测。

1.3.3精液常规检查以人工常规精液分析及计算机辅助精液分析检测精子浓度、活力等相关参数，每份标本检测均由两位资历经验丰富的检验工作人员校正核对。

1.3.4精浆ATP酶及CGRP浓度的检查实验原理双抗体夹心法:将抗体包装在固相载体微孔板，加入待检精浆标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗涤液洗去未结合的物质，存留抗原-抗体复合物，后加入抗原的HRP酶标记抗体，再洗去未结合的酶标抗体，加底物TMB显色，用酶标仪测量显色后的溶液吸光度，通过标准曲线计算样品中抗原浓度。精浆中CGRP检测实验步骤：(1)稀释标准品以试剂盒提供原倍标准品和标准稀释液，按表1进行操作。(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 μl，待测样品孔中先加样稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl(样品最终稀释度为5倍)。(3)温育：用封板膜封板后至37℃温育30分钟。(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释备用。洗涤：揭掉封板膜，丢弃液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。(5)加酶：每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外。重复以上温育及洗涤操作，显色每孔先加入显色剂A 50 μl，再加显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟，终止每孔加终止液50 μl，终止反应。用酶标仪测定吸光度：以空白孔液体调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。(6)计算：以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线及直线回归方程式，根据样品OD值计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。同理行ATPase酶的检测。

2结果

弱精组、少弱精组、无精组、死精组、少精组及正常组的患者年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。各组精浆中CGRP及Na+-K+-ATP酶检测结果的组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1　标准品配置稀释步骤

表2　各组年龄、精浆中CGRP及Na+-K+-ATP酶的比较

3讨论

男性不育在精液常规常表现为精子数量上减少甚至为无精，精子运动上活性减弱甚至死精。精子的活力性与精子的获能密切相关，但精子获能过程中相关的复杂分子机制目前尚未完全探明，而近来研究表明Ca2+在精子一系列获能反应中扮演着重要的调节角色[4]。Ca2+内流引起精子内游离钙离子浓度改变而起作用[5]。相关研究发现，海胆精子的线粒体内增加钙离子浓度，降低钾离子浓度，提高线粒体内氧化磷酸化偶联效率，增加能量产出，精子的运动活性得以提高[6]。精子内钙离子来自内源性钙库的释放(比如位于精子鞭毛中段内线粒体钙库等)及外源性获取。细胞内线粒体的钙离子释放途径有钠离子依赖的钙离子释放比如Na+/Ca2+交换体及非钠离子依赖性钙离子释放如H+/Ca2+交换体等[7]。Na+/Ca2+及H+/Ca2+交换体继发性转运动力来源于Na+-K+-ATP酶转运带来的膜两侧Na+的浓度差。精子细胞膜上钙泵及钙离子通道是外源性钙离子重要的调节途径。钙离子通道的类型包括电压依赖性钙通道、递质门控通道比如环核苷酸门控通道、精子阳离子通道(CatSper)等。目前CatSper[8]钙离子通道经细胞膜片钳子技术证明存在人精子膜，并被认为是精子上最重要的钙通道。相关研究表明CatSper钙离子通道、环核苷酸门控通道与精子活性密切相关[5，9]。CGRP及其受体主要存在于中枢和周围神经系统，相关报道表明CGRP能降低细胞内Ca2+水平，通过对细胞膜Ca2+通透性改变而发挥作用，从而调节细胞内Ca2+，进而维持细胞的生理功能。CGRP与细胞上相应受体结合，促使细胞内环腺苷酸(cAMP)增多，促发一系列反应后活化蛋白激酶G，激活Ca2+-ATP酶进而降低细胞内游离钙离子[10]。Vignini等研究报道：比较弱精组和正常组的精子内Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性差异显著[11]。由此可见精子细胞的这两种ATP酶的活性与精子的活性密切相关。喹巴因是一种天然的Na+-K+-ATP酶特异性阻断剂，其可通过与精子细胞Na+-K+-ATP酶特异性结合后降低精子运动。Na+-K+-ATP酶的α4亚基是在人成熟的精子尾部特异性表达[12]，可能参与精子运动的调控，对精子运动有着十分重要的作用。

本研究结果显示，各组精浆中CGRP比较差异无统计学意义，推测精子上可能缺乏其受体，导致精浆中CGRP与精子运动无相关性。另外各组间精浆中Na+-K+-ATP酶含量比较也无统计学意义，说明精浆中Na+-K+-ATP酶与精子质量无明显相关性。推测精浆中CGRP、Na+-K+-ATP酶可能需要进入精子细胞内，通过对精子细胞内的线粒体等进行调节而发挥作用。本实验研究仅检测精浆中CGRP、Na+-K+-ATP酶，未检测精子(精子质膜及精子内)的CGRP、Na+-K+-ATP酶，故尚不可完全性排除CGRP、Na+-K+-ATP酶与精子质量的相关性，所以精子中CGRP、Na+-K+-ATP酶与精子质量的相关性有待于进一步研究。

参考文献

[1]Karsan N,Goadsby PJ.CGRP mechanism antagonists and migraine management[J].Curr Neurol Neurosci Rep,2015,15(5):25.

[2]谢海涛.CGRP对胃肠作用的研究进展[J].医学信息,2010,23(10):326-326.

[3]Brenker C,Zhou Y,Müller A,et al.The Ca2+-activated K+current of human sperm is mediated by Slo3[J].Elife,2014(3):e01438.

[4]Correia J,Michelangeli F,Publicover S.Regulation and roles of Ca2+stores in human sperm[J].Reproduction,2015,150(2):R65-76.

[5]Darszon A,Hernández-Cruz A.T-type Ca2+channels in spermatogenic cells and sperm[J].Pflugers Arch,2014,466(4):819-831.

[6]Zhou J,Chen L,Li J,et al.The Semen pH Affects Sperm Motility and Capacitation[J].PLoS One,2015,10(7):e0132974.

[7]陆久维,翟宇佳,孙飞.线粒体钙离子转运的研究进展[J].生物物理学报,2013,29(3):167-180.

[8]James F Smith,Yuriy Kirichok,Polina V,et al.Calcium Channel CatSper is a Non-Genomic Progesterone Receptor of Human Sperm[J].Biophysical Journal,2012,102(3):338a.

[9]Singh AP,Rajender S.CatSper channel,sperm function and male fertility[J].Reprod Biomed Online,2015,30(1):28-38.

[10]Poyner DR,Taylor GM,Tomlinson AE,et al.Characterization of receptors for calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin on the guinea-pig vasdeferens[J].Br J Pharmacol,1999,126(5):1276-1282.

[11]Vignini A,Buldreghini E,Nanetti L,et al.Free thiols in human spermatozoa:are Na+/K+-ATPase,Ca2+-ATPase activities involved in sperm motility throughperoxynitrite formation?[J].Reprod Biomed Online,2009,18(1):132-140.

[12]Jimenez T,Sánchez G,Blanco G.Activity of the Na,K-ATPase α4 isoform is regulated during sperm capacitation to support sperm motility[J].J Androl,2012,33(5):1047-1057.

(编辑：梁明佩)

A study on correlation between seminal plasma Na+-K+-ATP ase and calcitonin gene related peptide and sperm quality in men

HUANGQun,LIANGChaorong,WEIGaomeng,MENGDongdong

(DepartmentofUrology,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate correlation between seminal plasma Na+-K+-ATP ase and calcitonin gene related peptide(CGRP) and sperm quality in men.MethodsAccording to the standard of the fifth edition of “WHO Human Semen Examination and Treatment of Laboratory Manual”,research objects were divided into azoospermia group,oligospermia group,oligoasthenozoospermia group,asthenospermia group,necrospermia group and control group.Then,correlation between seminal plasma Na+-K+-ATPase and CGRP and sperm quality in men was studied through detecting the concentration of Na+-K+-ATP ase and CGRP in seminal plasma by double antibody sandwich method.ResultsDifference of the concentrations of Na+-K+-ATP ase of seminal plasma in different semen quality groups (azoospermia group,oligospermia group,oligoasthenozoospermia group,asthenospermia group,necrospermia group and control group) was not statistically significant(P>0.05).In addition,difference of the concentration of CGRP in seminal plasma among different semen quality groups was not statistically significant(P>0.05).ConclusionNeither concentration of Na+-K+-ATP ase of seminal plasma nor concentration of CGRP may not be correlated with quality of sperm.

【Key words】Na+-K+-ATP ase in seminal plasma;CGRP;quality of sperm

(收稿日期：2015-06-12修回日期：2016-04-29)

中图分类号：R698.2

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.02.001

作者简介：黄群，男，主任医师，医学学士，研究方向：泌尿及男性生殖系统。E-mail:huangqundao@163.com

基金项目：广西医疗卫生重点科研课题(重2012082)；广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(Z2012724)