胃癌组织中Keap1、IKKβ蛋白表达及意义

陈文标，杨维群，刘立飞，倪亚萍

1.泉州医学高等专科学校基础医学部， 福建 泉州 362011; 2.解放军第180医院病理科；3.福建医科大学附属泉州市第一医院病理科

胃癌组织中Keap1、IKKβ蛋白表达及意义

陈文标1，杨维群1，刘立飞2，倪亚萍3

1.泉州医学高等专科学校基础医学部， 福建 泉州 362011; 2.解放军第180医院病理科；3.福建医科大学附属泉州市第一医院病理科

目的 探讨Keich样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)和IκB 激酶β(inhibitor kappa B kinase β，IKKβ)在胃癌组织中的表达。方法 应用免疫组化法检测54例胃癌患者的胃癌组织及24例癌旁正常组织中Keap1和IKKβ蛋白的表达，分析Keap1和IKKβ蛋白的表达与胃癌临床病理特征关系及二者表达的相关性。结果 Keap1与IKKβ在胃癌组织中的表达高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义(P<0.05)；胃癌组织中Keap1蛋白的表达与淋巴结的转移具有明显相关性(P<0.05)，但与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型、组织分化程度无相关性(P>0.05)；胃癌组中IKKβ蛋白的表达与组织分化程度及淋巴结转移相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型均无相关性(P>0.05)；Keap1的表达与IKKβ的表达无相关性(r=0.2839，P>0.05)。结论 胃癌组织中Keap1、IKKβ蛋白表达异常，提示Keap1可能影响IKKβ介导的NF-κB信号通路，并在胃癌的发生、发展中发挥重要作用。

胃癌；Keap1；IKKβ；免疫组化

Keap1，又叫胞浆肌动蛋白伴侣分子(Kelch-like ECH-associated protein 1)，其主要功能是能够与靶标蛋白特异性结合，并通过与泛素蛋白激酶CUL3/RBX1组成复合体介导靶蛋白的泛素化降解，是体内各信号通路中一种非常重要的调节蛋白[1]。IκB激酶β(inhibitor kappa B kinase β，IKKβ)是IKK复合物中的一个催化亚基，能够激活核转录因子(nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)，在免疫应答、炎症、肿瘤发生、发展等过程中发挥重要作用[2]。Keap1最常见的靶标蛋白是核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-re-lated factor 2，Nrf2)，主要调控细胞抗氧化应激反应，研究发现Keap1-Nrf2信号通路在神经系统疾病、糖尿病、心血管疾病、炎症、肿瘤等疾病中发挥重要作用[3-5]。研究也证实Keap1除了能调节Nrf2介导的氧化应激反应，还能直接作用于IKKβ，介导IKKβ的降解，Keap1可能在 NF-κB信号通路的调控中起重要作用[6-7]。有关Keap1与IKKβ二者在胃癌组织中表达的情况及二者相关性尚未见报道，本研究采用免疫组化法检测Keap1和IKKβ在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达，分析两者之间在胃癌组织中表达的差异性与临床病理特征的关系，探讨二者表达差异与胃癌的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料标本来源于福建医科大学附属泉州市第一医院与解放军第180医院经手术切除的胃癌组织存档蜡块54例和相应癌旁正常组织(距癌≥5 cm)24例，所有病例的临床和病理资料完整。胃癌组织中，男32例，女22例，年龄38～79岁，平均年龄(55.9±5.2)岁；胃癌标本中鳞状细胞癌9例，腺癌45例；中高分化38例，低分化16例。患者术前均未进行相关肿瘤放化疗及其他针对肿瘤的治疗。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器与试剂：全自动组织脱水机(LEIKA TP1020)、组织包埋仪(LEIKA EG1150H)、冷冻切片机(LEICA CM1950，德国)，兔抗人多克隆一抗Keap1和IKKβ购自武汉博士德生物工程有限公司，免疫组化试剂盒UltraSensitiveTMSP购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 免疫组化检测及结果判定：石蜡切片脱蜡水化，采用枸橼酸盐缓冲液、微波炉内加热进行抗原热修复。一抗按1∶300稀释，按照免疫组化试剂盒说明书进行操作。实验结果以细胞质中Keap1和IKKβ蛋白出现均匀棕黄色颗粒为阳性表达，采用江苏捷达显微数码采集系统对免疫组织化学染色切片进行图像分析。

1.3 统计学处理采用 SPSS 16.0 处理数据，采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关性检验。以α=0.05作为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌及癌旁正常组织中Keap1与IKKβ蛋白的表达与癌旁正常组织比较，胃癌组织中Keap1与IKKβ蛋白多见于细胞质中，呈淡黄色或棕褐色颗粒(见图1)。Keap1与IKKβ在胃腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

图1 IKKβ(A1～A3)、Keap1(B1～B3)在胃癌组织、癌旁正常组织、空白对照组免疫组化检测(SP 400×)

表1 Keap1和 IKKβ蛋白在胃癌组织与癌旁正常组织中的表达

2.2 胃癌中Keap1和IKKβ蛋白的表达与临床病理资料之间的关系胃癌组织中Keap1蛋白的表达与淋巴结转移具有相关性(P<0.05)，但与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织分化程度、组织学类型无相关性(P>0.05)；胃癌组织中IKKβ蛋白的表达与组织分化程度和淋巴结转移具有相关性(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型无相关性(P>0.05，见表2)。

表2 Keap1和IKKβ蛋白的表达与胃癌临床病理特征的关系

2.3 胃癌组织中Keap1与IKKβ蛋白表达之间的相关性Spearman相关性分析显示，胃癌组织中Keap1与IKKβ的表达无相关性(r=0.2839，P>0.05，见表3)。

表3 胃癌组织中 Keap1和IKKβ蛋白表达之间的相关性分析

Tab 3 The correlation analysis of the expressions of Keap1 and IKKβ in gastric carcinoma

3 讨论

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤，研究发现其发生、发展与多条信号通路调控改变相关。Keap1是分子量为69 KD的细胞质蛋白伴侣分子，其一级结构含有624个氨基酸，核心功能区主要由DGR、IVR、BTB/POZ等三个结构域组成[8]。Keap1作为一种负调控蛋白,介导与之结合靶蛋白泛素化降解[1]，其中研究最多的靶蛋白是Nrf2，介导细胞的抗氧化反应[9]，与疾病的发生关系密切。

然而越来越多的研究发现，Keap1除了能调控Nrf2，同样也可以作用NF-κB信号通路中关键的调控蛋白IKKβ[6,10-11]，是调控众多信号通路的一个关键蛋白。IKKβ是经典NF-κB信号通路IKK激酶复合物(由IKKα和IKKβ激酶及调节元件NEMO组成的三聚体)的核心组分。IKKβ活性增加或过表达可以有效刺激炎症相关因子的分泌，如TNFα、IL-1、IL-6、IL-8、CSF-1和COX2等，在慢性炎症和感染导致癌症发生过程中起重要作用[2]。Lee等[6]研究发现Keap1的BTB/kelch区域能够与IKKβETGE(NQE36TGE39)修饰区域特异性结合。Jiang等[11]进一步研究发现IKKβ特异性结合Keap1的三个关键酪氨酸为Tyr525、Tyr574和Tyr334。Keap1特异性结合IKKβ，并与泛素连接蛋白CUL3-RBX1复合体相连,介导IKKβ的泛素化降解。因此，Keap1除了能调控Nrf2信号通路，同样能调控NF-κB信号通路，可能是细胞内信号通路相互沟通的桥梁[12]。本研究发现，在胃癌组织中，IKKβ的表达较癌旁正常组织高，差异具有统计学意义，说明IKKβ在胃癌组织已出现异常表达。但作为IKKβ的负调控蛋白，Keap1在胃癌组织中的表达却高于癌旁正常组织，与王敏等[13]在结肠肿瘤的研究结果相近。Spearman相关性分析显示两者的表达不具有相关性，推测可能与Keap1或者IKKβ基因发生突变有关。Thu等[14]对261份肺癌组织KEAP1/CUL3 E3泛素激酶复合体的基因功能进行分析发现，42%出现KEAP1/CUL3 E3基因的损伤，63%出现基因的异常表达，Keap1的基因敲除IKKβ与NF-κB的活性显著增强，NF-κB靶基因的表达水平明显升高。Keap1与IKKβ表达调节的失衡是否可能是肿瘤发生的一个重要因素有待进一步研究。

应用免疫组化方法分析Keap1、IKKβ在不同临床病理学因素下的表达特征，对于判断胃癌局部生物学行为、复发及预后具有重要意义。本研究结果表明，胃癌组织中Keap1蛋白的表达在有淋巴结转移者中要高于无淋巴结转移者；提示Keap1蛋白与胃癌的浸润和转移可能相关，在胃癌的早期即发挥抑癌作用，随着癌症的进展其抑制作用减弱，是否与Keap1结构发生突变有关尚需进一步研究。胃癌组中IKKβ蛋白的表达与组织分化程度及淋巴结转移明显相关(P<0.05)，表明IKKβ在促进肿瘤的发展及浸润转移中起到重要作用。

综上所述，本研究发现Keap1与IKKβ在胃癌组织中的表达高于癌旁正常组织，二者表达调节失衡，可能是肿瘤发生的一个重要因素。Keap1的表达与胃癌的淋巴结转移相关，IKKβ的表达与胃癌的分化程度和淋巴结转移具有相关性，有可能成为判断胃癌恶性程度和预后的参考指标，因此，对二者调控是否有可能成为胃癌治疗的一个新方向值得进一步研究。此外，有关Keap1与IKKβ调节失衡的原因，有待后续进一步研究。

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(责任编辑：马 军)

Expression and significance of Keap1 and IKKβ in human gastric carcinoma

CHEN Wenbiao1, YANG Weiqun1, LIU Lifei2, NI Yaping3

1. Department of Basic Medicine, Quanzhou Medical College, Quanzhou 362011; 2. Department of Pathology, the 180th Hospital of PLA; 3. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University in Quanzhou, China

Objective To investigate the expressions of Keap1 and IKKβ in gastric carcinoma．Methods The expressions of Keap1 and IKKβ were detected by immunohistochemistry in 48 cases of gastric carcinoma and 24 cases of adjacent normal tissue. The relationship of the expressions of Keap1 and IKKβ with the clinicopathological features of gastric cancers was analyzed. Results The expressions of Keap1 and IKKβ in gastric carcinoma tissue were higher than those in adjacent normal tissue (P<0.05). The expression of Keap1 was significantly correlated with lymph node metastasis (P<0.05), but was not correlated with the gender, age, tumor size, histologic type, degree of differentiation (P>0.05). The expression of IKKβ was significantly correlated with lymph node metastasis and the degree of differentiation (P<0.05),but was not correlated with gender, age, tumor size and histologic type. There was no correlation between the expressions of Keap1 and IKKβ (r=0.2839,P>0.05).Conclusion The expressions of Keap1 and IKKβ in gastric carcinoma are abnormal. The abnormal expressions of Keap1 and IKKβ may induce the signaling pathways of NF-κB, which result in the occurrence of gastric carcinoma．

Gastric carcinoma; Keap1; IKKβ; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.06.011

泉州医学高等专科学校校级课题(2009XJ02)

陈文标，讲师，硕士，研究方向：肿瘤免疫。E-mail：abiao-66@163.com

杨维群，教授，研究方向：病理学教学与科研。E-mail：745687571@qq.com

R735．2

A

1006-5709(2016)06-0638-04

2015-04-20