二硫键链接的两亲性嵌段合物的合成及胶束化研究*

姚 琳，余丽丽，梁 飞，尤 静，张隽荣，宁梓任

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

两亲性聚合物是一种高分子表面活性剂，将两种不同性质的嵌段链接在一起而形成，既有亲水性又含有亲脂性[1]，在水溶液中其疏水部分形成内核，亲水部分形成外壳[2]，内核可以将疏水性药物增容在核心，降低药物的毒副作用，外壳可对药物起保护作用，提高药物稳定性，同时通过对外壳进行结构修饰可以达到靶向作用[3]。而刺激响应型聚合物胶束体系可依靠不同pH[4]、温度[5]、氧化还原电位[6]、光照[7]、磁场[8]等达到靶向释放药物的目的。近年来，二硫键能够对谷胱甘肽(GSH)作出氧化还原响应的这种能力被用作了细胞内可触发释放的药物载体的构建，如MuhammadEjaz等[9]设计合成了一种含二硫键交联结构的聚甲基丙烯酸羟乙酯水凝胶，并验证了其GSH响应能力。Wang等[10]通过聚ε-己内酯(PCL)末端巯基与聚乙基乙烯磷酸(PEEP)末端吡啶基间的偶联反应，在PCL与PEEP之间引入单二硫键桥，并将此作为还原环境敏感性链接臂，合成了二嵌段聚合物PCL-SS-PEEP，其在水溶液中能够自组装成还原环境敏感型纳米颗粒。

为此，作者以ε-己内酯、聚乙二醇单甲醚(mPEG)为原料，通过偶联反应在聚乙二醇单元与聚己内酯单元之间引入二硫键合成一种新型的两亲性嵌段共聚物mPEG-SS-PCL，在对PCL进行改性的基础上增加刺激响应能力，使其有可能成为一种有效的药物载体。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

聚乙二醇单甲醚-2000(mPEG-2000)：质量分数98%，AlfaAesar；对硝基苯基氯甲酸酯(p-NPC)、2,2′-二硫二吡啶(Py-SS-Py)：质量分数98%，萨恩化学技术有限公司；二硫苏糖醇(DTT)：质量分数99%、辛酸亚锡[Sn(Oct2)]：质量分数95%、ε-己内酯：质量分数99%、甲醇钠：质量分数30%、2-巯基吡啶(Py-SH)：质量分数98%，均为阿拉丁试剂；胱胺二盐酸盐：质量分数96%，百灵威科技有限公司；2,2′-二硫二乙醇(HES)：Sigma-Aldrich；吡啶(pyridine)：分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

核磁共振波谱仪：AVANCEⅢ400MHz、傅里叶变换红外光谱仪：TENSOR27，德国BRUKER公司；紫外可见分光光度计：UV-2102pcs，尤尼柯(上海)仪器有限公司；马尔文激光粒度仪：ZEN3600，真空干燥箱：MalvernZetamasterUK；DZF-6050，上海旋轩实验设备有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S，旋转蒸发仪：RE-2000A，巩义市予华仪器有限责任公司；三用紫外仪：ZF-Z、台式高速离心机：TGL-16C，上海亭安电子仪器厂。

1.2 聚合物mPEG-SS-PCL的合成

1.2.1 亲水端——mPEG-SS-Py的合成

mPEG-SS-Py的合成路线见图1。

图1 mPEG-SS-Py的合成路线

具体合成步骤如下：将干燥的mPEG-2000(4g，2mmol))和吡啶(0.806mL，10mmol)溶于25mL二氯甲烷(DCM)，通N2，将p-NPC(1.614g，8mmol)溶于15mLDCM，0 ℃下逐滴滴加至反应体系，氮气保护下室温反应24h。反应结束后，冰浴沉降于乙醚中，抽滤真空干燥得到白色粉末状产物mPEG-NPC3.07g，转化率72.4%。

将mPEG-NPC(2.12g，约1mmol)溶于10mL二甲基亚砜(DMSO)，胱胺二盐酸盐(0.9g，4mmol)溶于25mLDMSO，加入2mL三乙胺，混匀后加入上述反应体系中，室温反应24h，通过薄层色谱(TLC)法检测产物生成情况。将反应液转入截留分子量为1 000的透析袋中，透析24h，收集浓缩液，真空干燥得白色粉末状产物mPEG-Cy1.60g，转化率73.5%。

将mPEG-Cy(1.31g，约0.6mmol)、DTT(0.37g，2.4mmol)溶于30mL水中，用盐酸(质量分数37%)调节pH至1.5，室温反应36h。待反应结束后，用NaOH(1.0mol/L)将pH调至中性，转入截留分子量为1 000的透析袋中，透析24h，收集浓缩液，真空干燥得淡黄色固体粉末mPEG-SH0.95g，转化率75.3%。

将mPEG-SH(0.66g，约0.3mmol)、Py-SS-Py(6.6mg，0.03mmol)、Py-SH(3.3mg，0.03mmol)溶于25mL水中，用盐酸(质量分数37%)调节pH至1.5，氮气保护下30 ℃水浴反应24h，期间可通过TLC法检测产物生成情况。待反应结束后，将反应液转入截留分子量为1 000的透析袋中，透析24h，收集浓缩液，冷冻干燥重得到白色粉末状产物mPEG-SS-Py0.411 3g，转化率62.0%。

1.2.2 酯端——巯基聚己内酯PCL-SH的合成

巯基聚己内酯PCL-SH的合成路线见图2。

图2 PCL-SH的合成路线

具体合成步骤如下：以Sn(Oct)2为催化剂，HES为引发剂，发生开环聚合反应生成PCL-SS-PCL，具体步骤如下：将干燥后的HES(0.308g，2mmol)、ε-己内酯(4.566g，40mmol)单体，Sn(Oct)2(4.6mg)混匀后通氮气110 ℃反应5h。反应结束后用少量THF溶解，冰浴沉降于乙醚中，离心分离，真空干燥得白色粉末状产物PCL-SS-PCL3.02g，转化率62.9%。

将PCL-SS-PCL(1.414g，约0.3mmol)和DTT(0.308g，2mmol)溶于18mLTHF，通N2，加入2mL甲醇钠，25 ℃氮气保护下反应30h。反应结束后，用少量THF溶解，冰浴沉降于乙醚中，离心分离，真空干燥得白色粉末状产物PCL-SH1.10g，转化率77.8%。

1.2.3 聚合物mPEG-SS-PCL的合成

mPEG-SS-PCL的合成路线见图3。

图3 mPEG-SS-PCL的合成路线

具体合成步骤如下：将0.300gmPEG-SS-Py溶于5mLDCM，用冰醋酸调节pH至3.0，将0.320gPCL-SH溶于5mLDCM，滴加至反应体系30 ℃氮气保护下反应48h。反应结束后，冰浴沉降于乙醚中，离心分离，冷冻干燥得白色固体粉末mPEG-SS-PCL0.3524g。

1.2.4 200μL5mol/L的盐酸

采用Ellman法[5]测定聚合物中的二硫键含量。分别取不同浓度胱胺二盐酸盐标准溶液(0.020 8，0.025 0，0.031 3，0.035 7，0.041 7，0.062 5mg/mL)1mL，加1.0mL去离子水、1.5mL质量分数4%的NaBH4，37 ℃恒温震荡(100r/min)反应1h，加200μL浓度为5mol/L的 盐酸，用1mol/L的NaOH调节pH至8，加3mL0.08mg/mL的5,5′-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)显色30min，在λ= 412nm处测吸光度Abs值。以吸光度A对胱胺盐酸盐浓度ρ作图，将二硫键折算成胱胺盐酸盐的标准曲线回归方程为A=21.005 8ρ-0.212 98，相关系数R2=0.998 6，线性关系良好，可作为定量分析的依据。

取mPEG-SS-PCL2mg用上述方法测定412nm处的吸光度A，计算样品的二硫键接入率。

1.3 聚合物的胶束化研究

1.3.1 阿霉素(DOX)标准曲线的绘制

以去离子水(娃哈哈)为溶剂，配制ρ(DOX)=5、10、15、20、30、40μg/L梯度的水溶液，分别在DOX最大吸收波长485nm处测其吸光度值，以ρ(DOX)为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制DOX标准曲线，得回归方程A=0.021 62ρ-0.004 92，相关系数R2=0.999 29，说明在5～40μg/L，线性良好，可以进行定量分析。

1.3.2 空白胶束的制备

在避光条件下，精密称取聚合物1.0mg，溶解于1mLTHF中，搅拌使聚合物在溶剂中充分舒展后(30min)，向体系中缓慢加入234.6μL(质量分数19%)水，搅拌2h，缓慢加入4mL水，40 ℃真空干燥至无THF，定容至10mL。

1.3.3 载药胶束的制备

采用透析法将10mg聚合物溶于750μLTHF和250μLDMF的混合溶液中，分别称取不同量(1、2、3、4、5mg)的DOX·HCl溶于250μL的DMF中，向体系中滴入1滴三乙胺(TEA)，使得DOX·HCl转变为DOX，加入聚合物溶液中，磁力搅拌30min，使得聚合物结构充分舒展，DOX充分分散。缓慢的滴加入5mL水中，继续搅拌1h，旋转蒸发除去体系中的THF，得到紫红色溶液。装入截留分子量1 000的透析袋，以超纯水为透析液除去未包载的DOX，每2h换一次透析液，透析12h后，将样品定容至10mL，即为载药胶束样品，将五组样品将分别标记为Z1、Z2、Z3、Z4、Z5待测。

1.3.4 空白胶束和载药胶束粒径的测定

采用动态光散射粒径测定仪(DLS)对空白胶束和载药胶束在溶液中的粒径进行测定。在进行胶束粒径测定前，分别取空白胶束和载药胶束各1mL用蒸馏水定容至50mL，超声10min，用0.45μm微孔滤膜过滤，再进行测定。

1.3.5 载药胶束的药物包封率和载药量的测定

取0.2mL的载药胶束样品置于棕色瓶内，在旋转蒸发仪上35 ℃旋干，加入2mL[V(DMSO)∶V(DCM)=1∶1]的混合溶剂溶解，超声溶解10min后，用台式高速离心机离心10min，取上清液，在485nm波长处测其吸光度值。根据DOX标准曲线的回归方程及公式1、2计算出载药胶束的载药量及包封率。

(1)

(2)

2 结果与讨论

2.1 聚合物的结构表征

mPEG-SS-PCL的红外图谱见图4。

σ/cm-1图4 mPEG-SS-PCL的红外图谱

PCL-SH(400MHZ,DMSO-d6的1HNMR图谱见图5。

其中：δ=4.45～4.48为端基和羟基相连的CH2峰(—CH2OH)，δ3.37为聚己内酯与酯基氧相连的CH2峰(—CH2—O—CO—)，δ=2.08为聚合部分与酯羰基相连的CH2峰(—COCH2—)，δ=1.82～1.86为与巯基间隔一位的CH2峰(—CH2CH2SH)，δ=1.37～δ1.44为聚合部分碳链CH2峰(—COCH2CH2CH2CH2CH2O—)，δ=1.21～1.25为聚合部分碳链最中间CH2峰(—COCH2CH2CH2CH2CH2O—)，因离酯基较远，所以更靠近高场。

δ图5 PCL-SH的核磁氢谱

mPEG-SS-PCL(400MHZ,DMSO-d6的1HNMR见图6。

δ图6 mPEG-SS-PCL的氢谱

其中：δ=3.51～3.52为mPEG中CH2特征峰(—CH2CH2O—)，δ=3.17为端基CH3O—信号峰，δ=2.09为疏水部分PCL与羰基相连CH2峰(—CH2CO—)，δ=1.92为—SS—右侧CH2—的信号峰，δ=1.67为PCL碳链CH2峰(—COCH2CH2CH2CH2CH2CH2O—)，δ=1.47为PCL碳链最中间CH2信号峰(—COCH2CH2CH2CH2CH2O—)。

为了进一步确定该聚合物结构，采用Ellman法对二硫键的含量进行了测定，实验测得该聚合物在412nm处测的吸光度为0.655，折算后2mg聚合物中二硫键的质量分数约为56.8%，说明聚合物结构中成功接入二硫键。

2.2 两亲性二嵌段聚合物的胶束化研究

2.2.1 空白胶束和载药胶束的粒径

结果测得空白胶束的平均粒径为117.7nm，粒径分布(PdI)为0.162，载药胶束的平均粒径为146.1nm，粒径分布(PdI)为0.220；载药后聚合物的粒径及分布都相应增加，可证明阿霉素已经载入胶束内。

2.2.2 载药胶束包封率和载药量的测定

不同ρ(DOX)聚合物的载药量和包封率见表1。

表1 聚合物胶束的载药量和包封率

结果表明随着聚合物中ρ(DOX)的增加，载药量和包封率逐渐增加，最高载药量和包封率分别为16.28%、54.26%，说明脂溶性内核对阿霉素的增溶作用良好，促进了其药物包载能力。

3 结 论

通过七步反应在聚乙二醇单元与聚己内酯单元之间合成了一种新型的二硫键链接的两亲性嵌段聚合物mPEG-SS-PCL，该聚合物能通过自组装形成胶束，并且对脂溶性药物DOX具有良好的载药能力，最高载药量为16.28%，包封率为54.26%。由于二硫键的引入，预测其具有氧化还原敏感性，可作为有效的药物载体进行进一步的研究。

参 考 文 献：

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