四种不同方法提取黄芪中黄芪甲苷的对比研究*

何 昊，许 畅，王兴中，苏 力，张家旭

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

黄芪(Astragali Radix)为豆科植物蒙古黄芪Asrtagalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Asrtagalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。黄芪中含有皂苷、黄酮、多糖等多类化合物，其中黄芪甲苷Astragaloside IV是黄芪中皂苷的主要成分[2]，也是其重要的生理活性成分，具有增强免疫力，消炎、降压、抗病毒、抗衰老、清除自由基等功效[3]。毛蕊异黄酮能够提高机体免疫功能，增强机体抗氧化能力，具有抗辐射、抗癌作用，能舒张血管平滑肌，保护心脑血管，还能保护脑细胞、提高记忆力，另具有激素样作用，可减少糖尿病并发症等[4]。因此，黄芪药材及多种制剂均以黄芪甲苷和毛蕊异黄酮为定性或定量指标成分。然而，黄芪中黄芪甲苷的含量并不高，因此需要选择一种高效便利的提取工艺，为黄芪甲苷的提取提供便利。煎煮法、渗漉法均为传统提取方法，特点为提取时间长，成本低；索氏提取法是连续回流提取法的一种，提取效率较高；CO2超临界流体提取法是在高压下CO2处于超临界状态而提取有效物质的一种技术，可以在接近室温下进行提取，具有无有机残留，无公害，分离简单等特点。

作者分别采用煎煮法、渗漉法、索氏提取法和CO2超临界流体提取法对黄芪中黄芪甲苷成分进行提取，比较提取条件、浸膏得率及黄芪甲苷质量分数，同时选择毛蕊异黄酮质量分数对比参照，最终结果为选择适当的黄芪甲苷提取方法提供参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

黄芪：购于西安市万寿路药材市场，经鉴定为膜荚黄芪Asrtagalusmembranaceus(Fisch.) Bge.。药材干燥、粉碎，过筛(筛孔尺寸：0.425 mm)后保存；黄芪甲苷对照品、毛蕊异黄酮对照品：质量分数>98%，上海源叶生物科技有限公司；乙醇、正丁醇：分析纯，乙腈：色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；浓氨溶液：分析纯，西安化学试剂厂；纯净水：广州屈臣氏食品饮料有限公司。

Waters1525高效液相色谱仪：美国Waters公司；Alltech ELSD 2000ES蒸发光散射检测器：美国Alltech公司；FW200A高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；MH-500型调温电热套：北京科伟永兴仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪、SHZ-D Ⅲ型循环水真空泵：巩义予华仪器有限责任公司；GR-202分析电子天平：日本AND公司；Thermo Micropure超纯水仪：赛默飞世尔科技；SFT-100XW型超临界萃取仪：美国Supercritical Fluid Technologie；渗漉柱:30 mm×300 mm、索氏提取器：500 mL,北京博美华科玻璃有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液配制

精密称取黄芪甲苷和毛蕊异黄酮对照品，甲醇溶解制成0.5 mg/ mL的对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的配制

煎煮法：称取黄芪药材粉末20 g，加入20倍量纯净水，持续煎煮2 h，过滤，减压浓缩至干。渗漉法：称取黄芪药材20 g，加入体积分数70%乙醇润湿，装入渗漉柱中，浸渍24 h，之后以0.3 mL/min速度渗漉提取，收集8倍量的渗滤液，减压浓缩至干。索氏提取法：称取黄芪药材粉末20 g，用滤纸包裹好，置入索氏提取器中，加入200 mL体积分数70%乙醇，回流提取4 h，减压回收溶剂至干。CO2超临界流体提取法：称取黄芪药材20 g，加入超临界萃取釜中，参数为压力40 MPa，萃取温度45 ℃，夹带剂为无水乙醇，静态萃取40 min，动态萃取30 min，CO2流速10 L/h，所得提取物留待HPLC检测。以上4种方法所得提取物均加水微热使其溶解，用水饱和正丁醇振摇萃取4次，每次200 mL，合并正丁醇，之后用氨试液(浓氨溶液400 mL，加水至1 000 mL即得)洗涤2次，每次200 mL，之后蒸干正丁醇。

1.2.3 液相色谱分析条件

色谱柱Kromasil C18分析柱(4.6 mm×150 mm)；流动相：V(乙腈)∶V(水)(0 min，0∶100；0～4 min，20∶80；4～8 min，40∶60；8～12 min，60∶40；12～16 min，80∶20；16～20 min，100∶0；梯度洗脱)；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；ELSD检测器；进样量20 μL。

2 结果与讨论

2.1 HPLC-ELSD法同时测定黄芪甲苷和毛蕊异黄酮质量分数的方法学验证

2.1.1 色谱条件的选择

由于黄芪甲苷仅在201 nm附近有末端吸收，因此采用紫外检测器导致噪音较大、重现性差。故实验采用HPLC-ELSD法同时对黄芪中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮的质量分数进行测定[5]。

采用HPLC-ELSD方法，以Kromasil Column C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)为色谱柱；乙腈和水为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL/min；蒸发光散射检测器，ELSD 参数：漂移管温度95 ℃，载气流速2.1 L/min。

2.1.2 液相色谱分析专属性实验

按照上述色谱条件，对标准品溶液进行混合进样测定分析，记录色谱图，结果见图1。

t/mina 黄芪甲苷和毛蕊异黄酮对照品

t/minb 黄芪药材供试品图1 标准溶液HPLC-ELSD图谱

以上结果证明该方法专属性好。

2.1.3 标准曲线的建立

精密吸取1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL标准品储备液，置于10 mL容量瓶中，加入定量甲醇稀释至刻度，按2.1.1的色谱条件分别进样20 μL，测定峰面积。分别以各组分的峰面积(y)为纵坐标，质量分数(x)为横坐标绘制标准曲线。结果如下。

回归方程：y=87.776x-0.188 6(r=0.999 2，n=6)。

以上结果证明线性关系良好。

2.1.4 精密度实验

取黄芪浸膏粉，按1.2.2制备样品溶液，在2.1.1色谱条件下测定，重复进样6次，每次20 μL，测得黄芪甲苷和毛蕊异黄酮色谱峰面积的RSD分别为2.7%和3.1%，见表1。表明该方法的精密度良好。

表1 精密度实验

2.1.5 稳定性实验

取黄芪浸膏粉末，按1.2.2制备样品溶液，分别于0，2，4，8，12 h测定，测定黄芪甲苷和毛蕊异黄酮质量分数的RSD分别为1.6%和2.1%，见表2。表明供试品溶液在12 h内稳定。

表2 稳定性实验

2.1.6 回收率实验

取黄芪浸膏粉末，分别加入对照品溶液6.0，4.0，2.0 mL，按1.2.2制备样品溶液，在2.2.1色谱条件下，进样20 μL。每个样品重复3次，计算平均回收率，结果见表3。

表3 回收率实验结果

2.2 四种不同提取方法质量分数测定及结果

采用煎煮法、索氏提取法、渗漉法和CO2超临界流体提取法4种不同的方法对黄芪药材进行提取，以干浸膏得率、黄芪甲苷得率、毛蕊异黄酮得率、提取时间、成本等多方面进行综合比较，结果见表4。

由表4可看出，CO2超临界流体提取法对于黄芪甲苷和毛蕊异黄酮提取率均最高，提取时间最短，但设备成本较高。

表4 四种不同提取方法的综合比较

3 结 论

同时选用浸膏得率、黄芪甲苷质量分数和毛蕊异黄酮质量分数作为观测指标，可综合考察各提取方法对黄芪中主要指标成分的提取效率，对于提取方法的选择更具有参考性。综合比较4种提取方法提取黄芪中黄芪甲苷的提取效率，以干浸膏得率以及黄芪甲苷和毛蕊异黄酮质量分数为标准，得出CO2超临界流体提取法提取时间最短，提取效率最高，是一种简便、快速，值得推广的提取方法，但是，CO2超临界流体提取法设备成本较高，这也是推广过程中需要注意的一点。

参 考 文 献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015版(一部)[M].北京：中国医药科技出版社,2015：302-303.

[2] Bian Y Y,Guan J,Bi Z M,et al.Studies on chemical constituents ofAstragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao[J].China Pharm J,2006,41(16):1217-1221.

[3] 段立军，孙博航.黄芪甲苷的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2011，28(5):410-416.

[4] 张冬青，王海宝，王淑芳，等.毛蕊异黄酮生物活性的研究进展[J].中国中药杂志,2015,40(22):4339-4345.

[5] 宋成英，封加福.HPLC同时测定黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(11):115-117.