脂联素在兔主动脉动脉粥样硬化斑块内的表达研究*

西安交通大学医学院第一附属医院心内科(西安710061)　王芝荣　舒　娟



脂联素在兔主动脉动脉粥样硬化斑块内的表达研究*

西安交通大学医学院第一附属医院心内科(西安710061)王芝荣舒娟

摘要目的：探讨脂联素在兔动脉粥样硬化斑块内的分布特点。方法：选择动脉粥样硬化新西兰兔12只，对照组12只，处死每组动物后取出主动脉，观察脂联素在各组动脉粥样硬化斑块中的表达。结果：动脉粥样硬化兔血管壁脂联素蛋白表达均显著低于正常对照组(P<0.05)。结论：脂联素蛋白在动脉粥样硬化兔血管壁表达显著减低，脂联素蛋白表达水平上调可抑制动脉粥样硬化的发展。

主题词脉动硬化/诊断细胞因子类/代谢胆固醇/代谢胰岛素抗体 动物，实验兔@脂联素

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种大、中型动脉血管的慢性非特异性炎症病变,也是目前公认为人群死亡的主要原因。脂联素(Adiponectin，APN)是一个与胰岛素抵抗关系最紧密的特异性细胞因子，由脂肪组织所表达和分泌，其功能为抑制脂质的聚集、使巨噬细胞对脂质吞噬减少、进而抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化[1]，从而延缓动脉粥样硬化的发生、发展[2]。本研究拟探讨兔动脉粥样硬化斑块内ANP表达的特点，为人类动脉粥样硬化的预防和治疗提供研究基础。

材料与方法

1实验动物及药品选择动脉粥样硬化新西兰兔12只，对照组12只，均为雄性，1月龄，体重1.4～1.7kg，购自西安交通大学实验动物中心。脂联素抗体(Anti-Adiponectin)购自北京博奥森生物技术有限公司。

2标本取材及留取用3%戊巴比妥钠(30mg/kg)全身麻醉实验动物后空气栓塞处死动物，取出各组动物主动脉，去除血管外组织，生理盐水冲洗后用中性甲醛液固定。

3免疫组化特异性染色免疫组织化学染色法观察主动脉血管内皮脂联素表达水平。结果判定：血管壁脂联素蛋白的表达阳性结果为血管壁染成棕黄色，显微镜显影系统采集图像，选择血管壁随机取3个视野(×400)，计算机自动测量并计算阳性信号积分光密度(A值)。

4 Western blot检测主动脉脂联素蛋白的表达提取总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白总浓度及变性。以50ug/孔总蛋白上样，行SDS-PAGE凝胶电泳，分离蛋白后转膜，加入一抗(1∶250鼠抗兔ANP单克隆抗体或者1∶1000鼠抗兔β-actin)4℃孵育过夜。TBST浸洗后加入二抗(羊抗鼠IgG，1∶1000稀释)4℃孵育过夜。应用凝胶扫描成像系统中进行扫描分析，以β-actin作为内参。

5统计学处理采用SPSS17.0统计软件处理所有数据，对满足正态分布的计量资料两组间比较采用t检验，用Pearson法行相关分析，以P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。

结果

1两组间AS斑块面积比较动脉粥样硬化组AS斑块面积与动脉内膜面积比值为(38.35±4.33)%，显著高于正常对照组(0．00±0.00)%，两组有显著性差异(P<0.05)。

2两组间动脉壁脂联素特异性染色阳性面积比较见图1。动脉粥样硬化组血管壁脂联素蛋白表达为0.465±0.045，显著低于正常对照组(0.643±0.073)，两组有极显著性差异(P<0.01)。

A 正常对照组　　　　　　 　　　　　　　　　 B动脉粥样硬化组

3 Western blot检测两组间主动脉脂联素蛋白的比较见图2。经Western blot检测发现动脉粥样硬化组血管壁脂联素蛋白表达为0.765±0.085，显著低于正常对照组(1.610±0.173)，两组有显著性差异(P<0.01)。

图2　两组间 Western blot检测主动脉脂联素蛋白的比较

4 脂联素蛋白与动脉粥样硬化斑块面积与动脉内膜面积比值的相关性分析为了进一步了解脂联素蛋白与动脉粥样硬化的关系，行脂联素蛋白与动脉粥样硬化斑块面积与动脉内膜面积比值的相关分析，通过分析发现脂联素蛋白与动脉粥样硬化斑块面积与动脉内膜面积比值呈显著负相关(r=-0.573；P<0.001)。

讨论

ANP是由脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白质，具有保护血管内皮细胞、抗动脉粥样硬化、调节胰岛素抵抗的作用[3]。此外APN还可使内皮细胞减少对白介素-8和组织因子等炎症因子的表达[4]，降低内皮细胞和白细胞相互作用[5]，抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化，减少对氧化的低密度脂蛋白摄取，降低脂质在泡沫细胞内堆积[6]，从而保护血管结构，抑制AS的发生、发展。以上研究清楚地描述了脂联素延缓动脉粥样硬化的发生、发展的机制，并阐明脂联素与AS密切相关。

本研究结果显示：动脉粥样硬化组主动脉血管壁脂联素蛋白表达显著低于正常对照组，且脂联素蛋白与动脉粥样硬化斑块面积与动脉内膜面积比值呈显著负相关。即主动脉血管壁脂联素蛋白表达阳性面积水平上调可在一定程度上延缓动脉粥样硬化的发生发展。随着对AS发病机制分子水平研究的不断深入，有ANP在抗AS中的作用将成为新的研究热点。

参考文献

[1] Ouchi N, Kihara S, Arita Y, et al. Adipocyte-derived plasma protein, adiponectin, suppresses lipid accumulation and classA scavenger receptor expression in human monocyte-derived macrophages [J]. Circulation，2001，103(8)：1057-1063.

[2] Zietz B, Herfarth H, Paul G, et al. Adiponectin represents an independent cardiovascular risk factor predicting serum HDL-cholesterol levels in type 2 diabetes [J]. FEBS Lelt, 2003, 545(2～3):103-104.

[3] Vaiopoulos AG，Marinou K，Christodoulides C，et al．The role of adiponectin in human vascular physiology[J]．Int J Cardiol, 2012,155(2) : 188-193.

[4] Chen YJ, Zhang LQ, Wang GP,et al. Adiponectin inhibits tissue factor expression and enhances tissue factor pathway inhibitor expression inhuman endothelial cells[J]. Thromb Haemost,2008,100(2): 291-300.

[5] Mahadev K, Wu X, Donnelly S, et al. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endo-thelial cells [J]. Cardiovasc Res, 2008,78(2) : 376-384.

[6] Tian L, Luo N, Klein RL，et al. Adiponectin reduces lipid accumulation in macrophage foam cells [J]. Atherosclerosis,2009,202(1)：152-161.

(收稿：2015-08-20)

The expression of adiponectin of aortic atherosclerosis plaque area in rabbits Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Medicol College，

Xi’an Jiaotong University(Xi’an710061) Wang ZhirongShu Juan

ABSTRACTObjective：To investigate the expression of adiponectin of aortic atherosclerosis plaque area in rabbits. Methods：12 atherosclerotic rabbits and 12 normal rabbits were sacrificed. Aortic atherosclerotic lesion area, intimal thickness and intimal / media thickness ratio were measured. Expression of adiponectin of aortic atherosclerosis plaque area in rabbits were detected. Results： Protein expression of adiponectin in normal rabbits is greater than that in atherosclerotic rabbits (P<0.01).Conclusion：Accelerated levels of adiponectin can slow down the speed of atherosclerosis.

KEY WORDSArteriosclerosis/diagnosisCytokines/metabolismCholesterol/ metabolismInsulin antibodiesAnimals,laboratoryRabbits@ Adiponectin

【中图分类号】R743.1

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7377.2016.01.002

*陕西省科学技术研究发展计划项目(2004K17-G22)