槲寄生凝集素抗胆管癌的作用及机制研究

陕西省友谊医院(西安710068)　高旭亮　王佐权　胡江波　詹俊宏



▲通讯作者

槲寄生凝集素抗胆管癌的作用及机制研究

陕西省友谊医院(西安710068)高旭亮王佐权▲胡江波詹俊宏

摘要目的：研究槲寄生凝集素是否具有抗胆管癌的作用并初步探讨其作用机制。方法：体外培养胆管癌细胞ICC-9810，根据培养液中槲寄生凝集素浓度的不同，分为对照组、1ng/ml组、10ng/ml组、100ng/ml组。干预48 h后收集标本。MTT法检测细胞活力，并计算肿瘤抑制率；流式细胞仪检测凋亡细胞比率；Western-blot方法检测Bcl-2蛋白表达情况。结果：干预48 h后，各实验组OD值出现了降低，且随给药浓度的增加，OD值逐渐降低，肿瘤抑制率逐渐增高(P<0.05)；凋亡细胞比率也随培养液中槲寄生凝集素浓度的增加逐渐升高(P<0.05)；Bcl-2蛋白表达量也随给药浓度的增加而逐渐降低。结论：槲寄生凝集素能够在体外抑制ICC-9810细胞的生长，并通过下调Bcl-2蛋白表达量而促进细胞的凋亡，而且这种作用随槲寄生凝集素浓度的增加而加强。

主题词胆管肿瘤槲寄生细胞迁移抑制细胞凋亡

槲寄生是一种古老的中药，属桑寄生科，被证明具有抑制肝癌、胰腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞生长的作用[1-3]。但是，榭寄生是否同样具有抗胆管细胞癌的作用，至今尚无研究表明。为了证明槲寄生同胆管癌的关系，我们进行了以下实验，现报道如下。

材料与方法

1材料DMEM培养基购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；Hoechst染色液、四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒、细胞质蛋白抽提试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；槲寄生凝集素购自美国Sigma公司。人肝内胆管癌细胞系ICC-9810购自中国科学院细胞库。

2细胞培养将ICC-9810培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素的DMEM培养基中，37℃ 孵箱中培养，隔天传代。

3分组及干预情况对照组：培养ICC-9810细胞，培养液中加入PBS作为对照； A组：培养液中加入槲寄生凝集素1 ng/ml；B组：培养液中加入槲寄生凝集素10 ng/ml；C组：培养液中加入槲寄生凝集素100 ng/ml；干预48 h后，收集细胞并进行检测。

4MTT比色法检测细胞增殖活性取对数生长期ICC-9810细胞，按每孔2.5×103个细胞接种于96孔培养板进行分组培养，每孔总反应体积为200μl。待细胞贴壁后换液并根据分组不同按上述方法给予干预，干预48 h后每孔加5 g/L的MTT 20μl，继续培养4 h后，吸净每孔中液体，再加入100 μl的二甲基亚砜，在37℃的水浴摇床上孵育10 min。待MTT结晶充分溶解后置酶标光度仪测定各孔在490 nm波长处吸光度的OD值。

5细胞抑制率计算依据MTT检测结果，通过以下公式计算细胞抑制率：抑制率=(对照组-实验组)/对照组×100%。

6Annexin/PI 法检测细胞凋亡药物干预48 h后，消化并收集细胞，4℃的PBS洗涤两次，再用250μl结合缓冲液重悬，调节细胞浓度至1×106/ml。吸取细胞悬液100μl置于5 ml的流式管之中，并加入5μl的Annexin V/FITC和5 μl 20 μg/ml的碘化丙锭溶液；混匀后置于室温避光孵育15 min；反应管中加入400 μl已稀释好的结合缓冲液，用流式细胞仪检测，488 nm的氩离子激光器作为光源，PI 发红色荧光。

7Western-blot 检测Bcl-2蛋白表达取对数生长期 ICC-9810细胞，将其接种于6孔板，调整细胞浓度为每孔1×105，12 h后分别应用不同浓度的槲寄生凝集素进行干预，48 h之后终止培养，并收集细胞提取蛋白，紫外吸收法测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白后转膜，把转上蛋白的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜放于含有5%的脱脂奶粉Tris盐缓冲液中封闭1h，再TBST 漂洗。分别加入抗人Bcl-2的一抗在4℃ 孵育过夜，之后TBST漂洗3次，每次10 min。加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育1h后，漂洗充分，最后采用电化学发光法显像，于暗室中X 射线曝光压片，再显影定影，最终得到目的蛋白条带。 该过程重复3次，并选用β-αctin 作为内参。结果应用Image-pro Plus 6.0软件进行灰度分析。各实验组结果同对照组的灰度值进行比对，得出相对于对照组的倍数变化情况。

8统计学方法计量资料通过均数±标准差的方式表达，应用SPSS 18.0统计软件进行分析。组间比较采用ANOVA的方法进行，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1MTT检测结果及肿瘤抑制率对比干预48 h后，MTT法检测ICC-9810细胞的OD值，对照组为0.765±0.098；A组为0.604±0.075；B组为0.413±0.051；C组为：0.233±0.034(图1)。各组相比差异有统计学意义(P<0.05)。计算各实验组的肿瘤抑制率，A组的肿瘤抑制率为：21.05%，B组为：46.01%；C组为：69.54%(图1)。各组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

图1　各组MTT值及肿瘤抑制率比较

2槲寄生凝集素对细胞凋亡的影响正常状态下培养ICC-9810细胞，发现仅有少量细胞处于凋亡状态(7.9%±1.8%)。而培养液中加入槲寄生凝集素后，ICC-9810细胞的凋亡细胞比例出现升高，且凋亡细胞比例随给药浓度的增加呈升高趋势。其中A组的凋亡细胞比例为：27.8%±3.96%，B组凋亡细胞比例为：47.3%±5.46%，C组凋亡细胞比例为：59.1%±6.38%(图2)。各组间对比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2　流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况

3Bcl-2蛋白表达情况正常状态下，ICC-9810细胞中Bcl-2呈高表达状态，而给予槲寄生生物凝集素后，Bcl-2蛋白表达出现降低，且蛋白表达降低程度随着给药浓度的增加而呈现出递减趋势(图3)。对比各组间灰度变化情况， A组较对照组灰度变化0.775±0.134倍，B组较对照组灰度变化0.469±0.068倍， C组灰度较对照组变化0.181±0.031倍(图4)。对比各组间灰度变化情况，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图3　Bcl-2蛋白表达情况

图4　较对照组各组Bcl-2倍数变化情况

讨论

槲寄生是桑寄生科灌木植物的总称，是一种半寄生的植物。中医认为槲寄生有祛风湿，补肝、补肾、强健筋骨、安胎、养血等作用，被用于风湿痹痛，腰膝酸软、胎动不安等症状的治疗[4]。此外，槲寄生还被发现具有抗肿瘤作用[5]。其抗肿瘤活性成分包括多糖、植物凝集素、多酚、生物碱等，其中凝集素是表现槲寄生各生物活性的最重要成分，并被用作为抗肿瘤的一种辅助治疗药物[6-9]。英国卫生最近也已经通过将槲寄生提取物作为一种化疗药物应用于临床中。现在市场上主要有Isorel、Helixor、Iscdor、Eurixor等多种槲寄生提取物制剂[9]。专家预测槲寄生也有望成为继紫杉醇后又一种植物源抗癌药物[9]。虽然近年来的研究不断表明，槲寄生能够抑制肝癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等的生长[1-3]，但其是否同样能够抑制胆管癌的进展，尚无研究表明。我们通过MTT这一简便检测细胞增殖活力的方法，发现应用槲寄生凝集素后，细胞活力明显下降，而且随着给药浓度的增加进一步减低，其肿瘤抑制率也呈递增趋势。这说明槲寄生凝集素同样能够明显抑制胆管癌细胞的增殖。但槲寄生凝集素抗究竟通过何种途径抑制了胆管癌细胞的增殖，我们进一步对细胞的凋亡进行了检测。

凋亡是细胞的一种程序性的死亡，与各种生理及病理刺激所引起的细胞死亡不同，凋亡在细胞形态上特征性表现为以细胞皱缩继而细胞碎片形成，之后被吞噬细胞所清除[9]。而肿瘤凋亡细胞比例的增加，直接表现为肿瘤生长的抑制。我们通过流式细胞仪检测发现，槲寄生凝集素能够促进ICC-9810细胞的凋亡细胞比例增加，而且随着槲寄生凝集素浓度的增加，凋亡细胞比例逐渐增加。

微观层面而言，凋亡的核心是通过多种信号通路引起caspase介导的细胞内蛋白酶激活，其中线粒体途径是引起细胞凋亡的最主要的途径之一[10]。该途径在激活过程中的关键是细胞色素C释放到胞浆中，引起caspase 9激活从而启动caspase级联反应。而细胞色素C由线粒体的释放则由Bcl-2所调节。当Bcl-2家族决定细胞将要死亡时，bax和bak形成聚合体进而穿透线粒体外膜导致细胞色素C及多种其他多种线粒体膜间隙蛋白的释放[11]。在本研究中我们发现，槲寄生凝集素能够下调Bcl-2蛋白的表达，且随给药浓度的增加其表达量也逐渐减低。这样的结果说明槲寄生凝集素是通过下调Bcl-2蛋白的表达从而促进ICC-9810的凋亡。

综上所述，槲寄生凝集素能够在体外抑制ICC-9810细胞的增殖，并通过下调Bcl-2蛋白表达途径而促进细胞的凋亡，而且这种作用随槲寄生凝集素浓度的增加作用增强。

参考文献

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[11]Correia C，Lee SH，Meng XW，etal.Emerging understanding of Bcl-2 biology：Implications for neoplastic progression and treatment[J].Biochimicaet ，2015，1853 (7)：1658-1671.

(收稿：2015-05-08)

【中图分类号】R735.8

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.010