灰树花液体摇瓶发酵的关键控制技术

李　蓉　张金钰　叶长文　吴银华　陈　丽（. 浙江省庆元县食用菌科学技术研究中心，浙江省丽水食用菌技术创新服务平台，浙江省食用菌工程技术研究中心，浙江 庆元 33800；. 浙江省庆元县委统战部，浙江 丽水 33800）



灰树花液体摇瓶发酵的关键控制技术

李蓉1张金钰2叶长文1吴银华1陈丽1
（1. 浙江省庆元县食用菌科学技术研究中心，浙江省丽水食用菌技术创新服务平台，浙江省食用菌工程技术研究中心，浙江 庆元 323800；2. 浙江省庆元县委统战部，浙江 丽水 323800）

关键字灰树花；液体发酵；控制技术

灰树花具有增强机体免疫力，抑制肿瘤、病毒，降低血压等功效。其子实体可通过固体栽培获得，但生长周期长，产量有限，无法满足灰树花深加工产品的加工需求。而液体深层发酵因不受子实体栽培季节的影响，不消耗林木资源，且培养周期短，成本低，产量高，有效成分的含量易于控制，已受到广泛关注。

从灰树花深层发酵液和菌丝体中提取的多糖，与子实体中提取的多糖具有同样的抑制肿瘤、提高机体免疫功能的作用。游明乐等研究表明，多种食用真菌液体发酵产物中的蛋白质、氨基酸、核苷类、多糖类及甘露醇等含量远高于天然或人工栽培的大型真菌子实体或菌核[1]。研究液体发酵法制备灰树花液体菌丝体对快速获取有效成分[2]，加快灰树花制种速度，提高菌种产量，对实现其工厂化生产，加快其在保健、医药等方面开发利用，促进农业、食品、医药工业的发展，具有一定的现实意义。

本文对灰树花摇瓶发酵中的两个重要过程和关键控制因素进行探讨，旨在为优化其液体发酵提供依据。

1　液体发酵培养基制备过程的关键控制技术

方维明等采用摇瓶发酵法对灰树花液态发酵的碳氮营养需求，及发酵条件对菌丝体的生物量和多糖产量的影响规律进行研究，发现灰树花菌丝生长碳源以葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉最佳；酵母粉为发酵中的最佳氮源，其次为酵母膏、蛋白胨[3]。顾顺明研究表明，无论是生物量还是多糖含量，玉米粉作为碳源时灰树花的深层发酵效果最佳；豆饼粉作为氮源时菌丝体生物量最高，酵母粉次之；麸皮作为氮源时菌丝体粗多糖含量最高，蛋白胨、豆饼粉次之[4]。孙克研究了影响灰树花菌丝体生长的各营养因素主次顺序为蛋白胨、玉米浆、葡萄糖、磷酸二氢钾，综合考虑灰树花所需营养的最佳组合为葡萄糖3%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.4%、玉米浆1.5%[5]。卜庆梅等经过液体菌种制备试验、栽培袋制备试验、出菇试验，确定灰树花液体发酵的最佳培养基为麦麸5%，玉米粉1%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.1%，维生素B10.002%[6]。

综上所述，灰树花摇瓶发酵培养基的制备中碳源、氮源、矿质元素的选择及含量至关重要。碳作为构成细胞物质的主要元素、菌丝体生长所需的能量来源，建议选择葡萄糖、玉米粉。氮作为细胞质和细胞核中蛋白质和核酸的主要元素，建议选择蛋白胨或酵母浸出膏。矿质磷元素一般在菌丝体生长、繁殖和代谢活动中起着重要的作用。

玉米粉、麦麸有利于灰树花菌丝球的形成，一般在培养的第3天即有菌丝球形成，第5天菌丝球生物量达到最大值。但玉米粉、麦麸会使发酵后发酵液粘性增大，菌丝球无法过滤，对测定菌丝生物量、多糖和蛋白含量有较大影响，作者采用不同含量的玉米粒浸泡进行液体发酵。图1为玉米粉含量对―庆灰151‖菌丝生物量的影响。

图1　玉米粒含量对―庆灰151‖菌丝生物量的影响

2　发酵过程的关键控制技术

摇瓶发酵过程控制包括接种量、发酵时间、发酵温度、摇瓶转速、摇瓶装液量、杂菌防控等因素。

2.1接种量

孙金旭等对灰树花真菌发酵条件所做的优化研究表明，小接种量不利于菌体的生长及多糖的产生，随着接种量的增大，培养10天后的菌体及多糖产量逐渐增加；接种量10%时，菌体及多糖产量达到最大，之后，随接种量增大而降低[7]。杨箐等研究表明，灰树花最佳种子培养基为马铃薯-葡萄糖-蛋白胨培养基，在接种量为10%的条件下进行深层发酵，灰树花菌丝体干重和胞外多糖的含量分别为5.325 g/L和0.53 g/L[8]。顾顺明等以不同接种量对种子培养基菌丝生物量的影响进行研究，结果表明，100 mL种子培养基中，菌丝生物量随着接种母种圆饼（6 mm直径）数量增加呈增加趋势，9个菌饼时达最高。表明灰树花发酵时接种量愈大，菌丝体得率愈高。但从具体可操作性考虑，一般取5%～10%。[4]

2.2发酵时间

灰树花发酵过程，前期是菌丝体生长，之后开始产生多糖，随着培养时间延长，多糖产量下降。孙克等研究表明灰树花发酵是一个pH不断下降的过程，在一级种子接入摇瓶后的2天内，pH变化持平，对应菌体量的变化也较小。此后3天pH开始稳步下降，菌体量也迅速增加。发酵4天后，菌体香气浓郁；发酵5天时进入停滞期，这时发酵液的粘度较大，溶氧量下降很快，菌体生长基本停止，菌体干重达1.42 g/100mL[5]。雷德柱和于淑娟研究灰树花菌丝球时发现，发酵早期菌丝充满活力，富有弹性，不容易被剪切、刮落，即使被刮落也能迅速恢复生长，因此核占菌丝球的体积比较小；发酵中期，菌丝生长速度下降，并开始分化，菌丝容易被刮落，菌丝弹性和长度下降，核占菌丝球的体积比上升；发酵后期，菌丝高度液泡化，弹性迅速下降，菌丝球变得非常光滑，进而从动力学方面初步解释菌丝球在不同时期变化的形态[9]。

2.3发酵温度

不同的灰树花品种菌丝生长的最适温度不同，温度梯度试验研究表明，尽管在最适生长温度下菌丝生长最快，但是菌丝相对较细，菌落稀疏；而低于菌丝生长最适温度以下2～3 ℃时，菌丝长速虽稍慢，但菌丝粗壮，菌落致密。目前已认定的3个灰树花品种，菌丝发酵最适温度：庆灰151、庆灰152为25～31 ℃，小黑汀为22～31 ℃。

2.4摇瓶转速

摇床转速是发酵过程的重要参数，直接影响发酵基质的传递速度和溶氧量。崔凤杰等研究了搅拌转速和通气量对灰树花深层发酵培养的影响，表明低搅拌转速（60 r/min和80 r/min）下菌球直径较大，紧密；随着转速提高，菌球直径下降并趋于松散，搅拌速度在一定范围（60～100 r/min）内与发酵液最终粘度呈正相关[10]。选取不同摇瓶转速（50、100、150、200、250、300 r/min）进行发酵研究，接种后置于25 ℃、装液量100 mL（500 mL三角瓶）条件下振荡培养10天，测定灰树花菌体及多糖的产量在转速150 r/min下为高。

2.5摇瓶装液量

摇瓶装液量是影响发酵过程溶氧量的一个重要因素。孙金旭和顾顺明的研究同时表明500 mL三角瓶中装液100 mL为摇瓶发酵培养灰树花的适宜装液量。

2.6杂菌控制

灰树花发酵过程防控杂菌污染也是关键。要做到无菌接种。同时，在摇菌过程中在三角瓶塞上覆盖一层软质纸后再用橡皮筋固定，可以大大减少杂菌污染几率。

3　结　论

灰树花液体发酵技术的应用越来越受到人们的重视，科学配制发酵培养基，合理控制发酵过程中的接种量、发酵时间、发酵温度、摇瓶转速、摇瓶装液量和防止杂菌污染等，是确保灰树花液体发酵成功的技术关键。

参考文献

[1] 游明乐. 中国食(药)用真菌发酵工程研究进展[J]. 微生物学通报, 2007, 34(2): 327-331.

[2] 汪维云. 灰树花液体深层培养及微量元素富集作用研究[D]. 江苏理工大学博士论文, 1999.

[3] 方维明, 鲁茂林, 汪志君. 营养因子对灰树花多糖发酵的影响[J]. 江苏农业研究, 1999, 20(4): 65-68.

[4] 顾顺明, 孙晔, 王潞江, 等. 发酵法生产灰树花菌丝体的研究[J]. 工业微生物, 2003, 33(4): 1-4.

[5] 孙克, 许正宏, 敖宗华, 等. 灰树花发酵条件的研究[J].药物生物技术, 2002, 9(2): 91-93.

[6] 卜庆梅, 倪艳波, 黄清荣, 等. 灰树花液体发酵培养基的筛选试验[J]. 江苏农业科学, 2003, 6: 103-105.

[7] 孙金旭, 朱会霞, 李书珍. 灰树花真菌发酵条件优化研究[J]. 食品与机械, 2009, 25(6): 131-134.

[8] 杨箐, 郝利民, 刘元, 等. 种子深层培养对灰树花生长的影响[J]. 食品研究与开发, 2009, 30(1): 49-52.

[9] 雷德柱. 于淑娟.灰树花深层发酵过程中菌丝球形态结构的研究[J]. 食用菌学报, 2003, 10(1): 6-11.

[10] 崔凤杰, 陶文沂, 许泓瑜, 等. 搅拌转速和通气量对灰树花深层发酵的影响[J]. 食品与生物技术学报, 2006, 25(4): 67-80.

“2016最具投资价值食用菌企业top10”颁奖仪式在四川金堂举行

2016年3月11日，在四川金堂恒大酒店举行的第三届四川（金堂）食用菌博览会期间，―2016最具投资价值的食用菌企业top10‖颁奖仪式在中国食品土畜进出口商会食用菌分会二届三次会员扩大会议上举行，来自国内外100多人参加见证了此次活动。

中国绿宝集团有限公司、北京金珠满江农业有限公司、天水众兴菌业科技股份有限公司、福建万辰生物科技股份有限公司、江苏华绿生物科技股份有限公司、河南景翔生物科技股份有限公司、南通三盛鑫生物科技股份有限公司、湖北裕国菇业股份有限公司、安徽中祝农业发展有限公司、广东星河生物科技股份有限公司,共10家企业荣膺―2016最具投资价值的食用菌企业top10‖。九州证券有限公司执行总经理万伟先生，中国食品土畜进出口商会食用菌分会秘书长、易菇网顾问刘自强先生，易菇网总裁张升明先生为获奖单位颁发了奖牌和证书。

为加强食用菌企业对资本市场的了解，熟悉资本市场的运作，提升公众对食用菌上市公司的关注，易菇网特发起举办此次活动，选取近几年公开报道在主板市场、创业板市场、新三板上市食用菌企业作为评选对象，自2016年1月29日至2月18日期间进行公众投票，历时21天，此活动引起业内人士的广泛关注，票选信息在网络和手机媒体中被广泛传播，参与投票人数达12 509人。

（摘编自2016.3.12《易菇网》http://www.emushroom.net/news/201603/12/25470.html）

中图分类号：S646

文献标识码：B

文章编号：2095-0934（2016）02-115-03