不同倍性花生光合特性研究

梅　辉，韦　琴，付秀芹，江　楠

(1. 武汉生物工程学院生命科学与技术学院，湖北 武汉 430415；2. 武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北 武汉 430065)



不同倍性花生光合特性研究

梅辉1，韦琴2，付秀芹1，江楠1

(1. 武汉生物工程学院生命科学与技术学院，湖北 武汉 430415；2. 武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北 武汉 430065)

摘要：用0.01%秋水仙素诱导使花生染色体加倍，通过单细胞内染色体数目和DNA含量鉴定花生倍性，比较不同倍性花生叶片的气孔大小、气孔密度和叶绿素含量。结果表明：秋水仙素加倍处理后的花生叶片气孔更大，单位面积的气孔数量减少，叶绿素含量增加。

关键词：秋水仙素；花生；不同倍性；气孔；叶绿素

多倍化是植物进化变异的自然现象，也是促进植物进化的重要力量，多倍体化现象在植物界相当普遍[1]。植物多倍体化后往往带来外部形态、光学特性、抗逆性等一系列改变。近年来关于植物多倍体研究报导较多，研究结果不尽一致。徐伟钰等[2]在研究二、四倍体萝卜光合特性时发现，四倍体叶绿素含量明显高于二倍体，且气孔增大，气孔密度减小；李为[3]在研究不同倍性甜瓜生物学特性时发现，不同倍性甜瓜单位叶面积的叶绿素a和叶绿素b含量随着染色体倍性的增加而增加；但侯喜林等[4]在研究白菜不同倍性材料间光合特性差异时发现，不同倍性白菜叶绿素a和叶绿素b含量差异不显著。

多倍体植物由于细胞内含物增加往往表现出形态增大、营养物质增加、抗逆性增强等特点。三倍体和四倍体西瓜的耐热性优于二倍体西瓜[5]；异源八倍体小黑麦具有结实率高、饱满度好、营养品质优等特点[6]。花生是我国重要的油料作物之一，在农业经济中占有重要地位。花生栽培种为异源四倍体(2n=4x=40)，包括两个染色体组[7]。目前尚无对花生八倍体的相关研究。本实验用秋水仙素对花生进行诱导加倍，采用一种全新的单细胞DNA含量鉴定法，对不同倍性的花生叶片的光合特性进行比较，旨在为花生多倍体育种及优良花生品种的选育奠定理论依据。

1材料与方法

1.1材料及试剂

花生种子由中国农科院油料作物研究所惠赠；秋水仙素购自上海悠祥生化试剂有限公司；纤维素酶、果胶酶购自武汉华顺生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1根尖染色体装片制作及倍性鉴定用0.01%秋水仙素浸泡花生种子4h，然后换清水清洗后沙土培养致花生胚根长到6cm。采用去壁低渗火焰干燥法[8]制作花生染色体装片。

将制作好的染色体装片用两种方法进行倍性鉴定，一是经Giemsa染液染色后直接镜检，通过染色体数目确定倍性；二是定量测定装片上单个间期细胞DNA含量。由于染色体加倍后，多倍体细胞DNA含量随之加倍，因此可通过定量测定各单个细胞内DNA含量来鉴定细胞的倍数。将干燥后的单细胞装片进行染色固定后，利用DNA含量自动检测仪进行分析(武汉兰丁医学高科技有限公司)，分别记录装片上单个细胞核DNA含量的数据，随机选取20个样本数据进行分析，比较经秋水仙素加倍后的花生根尖细胞核DNA含量和未经秋水仙素处理的空白对照组花生根尖细胞核DNA含量差异。

1.2.2叶表皮装片制作取生长至15cm高的植株第4片展开叶(自基部算起)，用锋利刀片切取靠近中部主脉两侧组织，切取叶片为1～2cm左右。用镊子撕取叶下表皮，置于干净的载玻片上，碘液染色后显微镜检，观察气孔形态，统计气孔数目，计算气孔密度(个数/mm2)。计算方法：显微镜目镜的视野直径为18mm，根据S=πR2计算显微镜的视野面积为254.64 mm2，因高倍镜放大400倍，所以实际观测的视野为0.636 mm2，据此计算气孔密度[9]。

取强光照射1.5h的花生叶片，用透明指甲油均匀涂在叶片下表面。待完全干燥后揭取下并制成气孔装片。用0.1mm的目镜测微尺测量21个气孔的大小，计算气孔长和宽的平均值[9]。计算方法：在光学显微镜高倍镜下将目镜测微尺和镜台测微尺进行校对，将镜台测微尺第8个刻度与目镜测微尺第28格对齐。通过公式：

目镜测微尺格值(μm)=镜台测微尺两重合线间的格数×10/目镜测微尺两重合线间格数计算得到目镜测微尺的格值为2.86μm。将高倍镜下用目镜测微尺测得的气孔所占目镜测微尺格数乘目镜测微尺格值，所得即为放大400倍后气孔开启时的长、宽数数值，测量样本数不低于20[9]。

1.2.3叶绿素含量测定[10]称取洁净并已去中脉的新鲜功能叶0.1g，加入少量石英砂和95%的乙醇3mL，研磨成匀浆，再加入95%乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置5 min后过滤并洗涤残渣至无色，用95%乙醇定溶后测定665nm、649nm和470 nm的吸光值，根据公式计算叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素的质量浓度(mg/L)。计算公式：

Ca= 13.95A665- 6.88A649

Cb= 24.96A649- 7.32A665

C总= Ca+ Cb

(每个样品重复3 次，取平均值)

图 1　不同倍性花生根尖细胞染色体图 (10×100)Fig.1　Chromosome number of peanut root tip cell with different ploidy (10×100)

2结果与分析

2.1根尖染色体倍性鉴定

由图1可辨认出不同倍性花生染色体之间的差异，经秋水仙素加倍后的花生根尖染色体条数明显多于未经秋水仙素处理过的花生。粗略统计图1-B的染色体条数，连结在一起成团的及辨认不清的不计，共得染色体53条。若加上辨认不清的染色体，则可判断经过秋水仙素加倍后的花生为八倍体。

2.2DNA细胞自动检测分析仪进行倍性鉴定

由于花生染色体数目多且染色体小，不易辨认，所以同时采用了单细胞DNA含量鉴定法对细胞的倍性进行鉴定。DNA细胞自动检测分析仪对各装片的单个细胞核DNA含量进行扫描，扫描样本数为20个单细胞，统计结果见表1。结果显示，秋水仙素处理过的花生根尖细胞DNA含量明显高于空白对照组，其含量约是空白对照组的2倍，说明秋水仙素处理使染色体加倍，单个细胞内DNA含量加倍。

2.3叶表皮(气孔大小及密度)

2.3.1气孔形态碘液染色后的气孔装片显微镜检，结果见图2，空白对照组气孔保卫细胞圆且厚，整体形态接近卵圆形，叶绿体分散排列，副保卫细胞形状较规则，接口处狭窄。秋水仙素处理后保卫细胞更细长，叶绿体集中排列在保卫细胞外侧，副保卫细胞边缘规则度不高。接口处较宽。通过气孔形态的差异分析，加倍后的花生保卫细胞在吸水后更易牵动微纤丝使气孔打开。

2.3.2气孔大小和密度显微镜检测放大400倍后气孔开启时的长、宽平均数统计数据见

表1　花生根尖细胞装片处理组与空白组DNA含量比较

表2。由表2可见，经秋水仙素加倍的花生叶片气孔大于未加倍的花生植株叶片。这种开度更大的气孔，能减少蒸腾阻力，有利于花生植株体内水分和矿物营养的运输。同时加强了光合作用中气体交换的力度，有利于光合作用的顺利进行和加速有机物的合成。因而推测加倍后的花生在抗逆性方面更具优越性。表2所示，秋水仙素加倍处理后，单位面积内气孔数目略减少，气孔密度有所降低。这一结果和气孔大小结果对应，正是由于加倍后气孔增大，而导致气孔密度降低。

2.4叶绿素含量

秋水仙素处理使得花生染色体加倍后，八倍体花生叶片叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量均高于未处理的四倍体，说明八倍体花生植株的光合性能优于四倍体(表2)。

图 2　不同倍性花生叶片气孔形态(10×100)Fig.2　Stomatal morphology of peanut leaves with different ploidy

气孔特征Stomatalcharacteristics长(μm)Length宽(μm)Width数目Numbers密度Density叶绿素含量(mg/L)ChlorophyllcontentCaCbC总空白对照组Normalgroup19.68±2.853.54±0.8613.7±2.5521.59±4.034.4141.6446.058秋水仙素处理组Colchicinetreatmentgroup23.90±2.366.18±1.2312.1±1.5019.07±2.365.6322.3828.012

3讨论

多倍体育种在植物育种中广泛应用，秋水仙素诱导使染色体加倍是植物多倍体育种常用的方法。多倍体由于染色体组成倍增加，而导致细胞内含物增多，通常会使植株在外部形态、生理特征、营养成分及生态适应性等方面发生相应改变，使植株体现多倍体优越性，尤其在药用植物中被广泛应用[11]。

多倍体育种常存在多倍体倍性鉴定的问题，最传统的鉴定方法是制作染色体装片，通过显微镜检确定染色体数目，进而确定倍性。但对于大部分双子叶植物，由于本身染色体小且染色体数目多，而使得染色体数目难以确定。2010年之后出现一种新的采用流式细胞术鉴定细胞核DNA含量来鉴定植物多倍体倍性的方法[12-14]。本研究在此基础上尝试了一种全新的方法。制备细胞装片，采用武汉兰丁医学高科技有限公司的DNA含量自动检测仪扫描装片上的单细胞，通过DNA含量确定倍性。这种方法操作简单，并与染色体数目鉴定结果一致。

多倍体育种是一个复杂的问题，其研究虽然取得一定进展，但仍存在许多问题。针对不同植物，由于染色体数目和大小不一样，而细胞核空间有限，能容纳的染色体数目有一定限度，因此，要对生物体不同倍性进行比较以确定其最佳倍性。野生花生为二倍体，目前的栽培种是四倍体，秋水仙素能成功将其加倍为八倍体，且加倍之后气孔增大，叶绿素含量增加，光合特性体现出优越性，但能否培育出结实率更高的花生八倍体还有待进一步研究。

参考文献：

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[3] 李为. 不同倍性薄皮甜瓜的生物学特性研究[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2013.

[4] 侯喜林，徐明宇，张蜀宁. 白菜不同倍性材料间光合特性差异研究[J]. 园艺学报，2006，33(6):1338-1340.

[5] 何毅，张力，陆杰思，等. 高温对不同倍性西瓜生理特性及果实品质的影响[J]. 贵州农业科学，2015，43(6):158-161.

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Research on Photosynthetic Properties of Different Ploidy Peanut

MEI Hui1, WEI Qin2, FU Xiu-qin1, JIANG Nan1

(1.DepartmentofBioscienceandBiotechnology,WuhanInstituteofBioengineering,Wuhan430415,China; 2.EnvironmentalandBiologicalEngineeringCollege,WuhanTechnologyandBusinessUniversity,Wuhan430065,China)

Abstract:0.01% colchicine was used to induce doubling of peanut chromosomes, and peanut ploidy was identified through single cell chromosome number and DNA content. By comparison of leaf stomatal size, stomatal density, chlorophyll content of different ploidy peanut, it was find that: after colchicine doubling treatment, the size of peanut leaf stomatal became larger, with the reduced number of stomata per unit area and the increased chlorophyll content.

Key words:colchicine; peanut; different ploidy; stomata; chlorophyll

中图分类号：S565.201; Q343.2+44

文献标识码：A

作者简介：梅辉(1981-)，女，湖北襄阳人，武汉生物工程学院讲师，硕士，主要从事植物遗传育种研究。E-mail:52884653@qq.com

基金项目：武汉市教育局科研项目 (2009K089)

收稿日期：2015-12-29

DOI：10.14001/j.issn.1002-4093.2016.01.006