复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠心肌TGF-β1及CTGF表达水平的影响研究

屈会云，王立新

(河北医科大学附属沧州中西医结合医院，河北 沧州 061001)



复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠心肌TGF-β1及CTGF表达水平的影响研究

屈会云，王立新

(河北医科大学附属沧州中西医结合医院，河北 沧州 061001)

[摘要]目的观察经验方复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠心肌转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)的影响，探讨其对糖尿病心肌病的可能作用机制，为临床防治糖尿病心肌病提供可靠的实验依据。方法将雄性Wistar大鼠88只随机分为正常组、模型组、复荣通脉胶囊低剂量组及复荣通脉胶囊高剂量组，每组22只。除正常组外，其余组均采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型。造模成功后，复荣通脉胶囊低剂量组和高剂量组分别给予复荣通脉胶囊混悬液0.67 g/(kg·d)和1.34 g/(kg·d)灌胃，正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。连续灌胃8周后，测量各组体质量、血糖、TC、TG，免疫组化法检测心肌组织中TGF-β1、CTGF表达情况。结果灌胃8周后，正常组体质量明显高于灌胃前(P<0.05)，模型组和复荣通脉胶囊低剂量组、高剂量组体质量均明显低于灌胃前及正常组(P均<0.05)；各组血糖水平与灌胃前比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，模型组和复荣通脉胶囊低剂量组、高剂量组比较差异也均无统计学意义(P均>0.05)；各组间TC比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，模型组TG明显高于正常组(P<0.05)，复荣通脉胶囊低剂量组、高剂量组TG与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；复荣通脉胶囊高剂量组心肌组织中TGF-β1、CTGF表达水平明显低于模型组和复荣通脉胶囊低剂量组(P均<0.05)。结论复荣通脉胶囊可下调TGF-β1、CTGF在糖尿病大鼠心肌组织中的表达，从而发挥其对糖尿病心肌病的治疗作用，但具有剂量依赖性。

[关键词]糖尿病心肌病；复荣通脉胶囊；转化生长因子β1；结缔组织生长因子

糖尿病心肌病(diabetio cardio myopathy，DCM)是糖尿病的微血管病变之一，亦是导致糖尿病患者死亡的重要原因之一。有研究显示补阳还五汤对糖尿病有治疗作用[1]，且加味补阳还五汤能够改善糖尿病患者的微循环障碍[2]。我院制剂复荣通脉胶囊是在补阳还五汤的基础上加减化裁而成，在临床应用中可明显改善糖尿病心肌病患者胸闷、憋气症状，提高左室射血分数，但作用机制尚未明确。本实验通过观察复荣通脉胶囊对糖尿病心肌病发生发展过程中起着极为关键作用的转化生长因子β1(TGF-β1)、 结缔组织生长因子(CTGF)的影响，探讨复荣通脉胶囊可能的作用机制及作用靶点，为防治糖尿病心肌病提供科学、客观的实验依据。现将结果报道如下。

1实验资料

1.1实验动物88只健康雄性Wistar大鼠，体质量180～210 g，由北京维通利华生物有限公司提供，动物合格证号：11400700005601，单位许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2试剂链脲佐菌素(STZ)、柠檬酸钠(美国Sigma公司)，TGF-β1、CTGF免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。复荣通脉胶囊含水蛭、全蝎、地龙、当归、黄芪、玄参、川牛膝、葛根、首乌藤、甘草、穿山龙，院内制剂，批准文号：冀药制字Z20070041，生产批号：130301，规格：每粒0.5 g，相当于生药2 g。使用时按比例加蒸馏水制成混悬液。

1.3实验方法

1.3.1动物分组及造模将88只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、复荣通脉胶囊低剂量组及复荣通脉胶囊高剂量组，每组22只。适应性饲养10 d后准备造模，所有大鼠于造模前禁食12 h。参照文献[3]方法，各造模组均予腹腔一次性注射1% STZ(临用前将STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.2的无菌柠檬酸缓冲液中，10 min内用完)60 mg/kg，正常组一次性腹腔注射等容量柠檬酸缓冲液。造模72 h后，尾静脉取血测量血糖值，血糖值≥16.7 mmol/L确定为造模成功。造模过程中大鼠无死亡，血糖值未达标10只弃去不用，最后纳入观察的大鼠正常组22只，模型组18只，复荣通脉胶囊低剂量组、高剂量组各19只。

1.3.2给药方法造模成功后24 h开始给药。参考《药理实验方法学》，按人体-大鼠体表面积比值表换算出大鼠的等效剂量，复荣通脉胶囊低剂量组和高剂量组分别给予复荣通脉胶囊混悬液0.67 g/(kg·d)和1.34 g/(kg·d)灌胃，正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。大鼠灌胃容量10 mL/(kg·d)，连续8周。实验阶段大鼠进标准饮食，自由饮水，实验室温度控制在(24±2)℃，实验过程中各组均未使用其他任何药物。

1.3.3标本留取方法灌胃8周后，所有大鼠空腹称体质量，尾静脉取血测血糖。接着以3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血2 mL置于不抗凝管，分离血清，用日立7600-010全自动生化分析仪检测TC、TG。然后开胸取出心脏，冰生理盐水冲洗，滤纸吸干，取心尖部心肌，切成2 mm×2 mm×2 mm左右的组织块，放入盛有4%中性甲醛固定液的小瓶内, 送病理室行TGF-β1、CTGF免疫组化检测。

1.3.4免疫组化测定方法石蜡切片厚4 μm，常规脱蜡至水；将切片置于3%过氧化氢甲醇溶液中，室温震荡约15 min以封闭内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗2次，每次5 min；采用微波修复法进行抗原修复。之后用0.01 mol/L PBS洗2次，每次5 min；加入正常山羊血清，温度37 ℃，30 min以封闭内源性生物素；将血清甩掉，加一抗，4 ℃过夜。再次用0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃，25 min。继续用0.01 mol/L PBS连续冲洗3次，每次5 min，然后滴加辣根酶标记链霉卵白素(SP)，37 ℃，20 min。接着用0.01 mol/L PBS冲洗4次，每次5 min。用新配制的DAB液显色，在光镜下控制显色程度；最后用蒸馏水冲洗、终止显色。苏木素轻度复染，脱水、封片。

1.3.5结果判定免疫组化结果用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统分析，TGF-β1阳性表达主要在大鼠心肌细胞胞质，CTGF阳性表达主要在大鼠心肌间质细胞，两者在血管周围也可出现阳性表达。镜下随机选择5～10个视野，计数100～200个细胞，胞浆黄染为阳性。染色判定用二级计分法，即根据阳性细胞染色强度及阳性细胞百分数分级，最后以二者分数之和作为最终结果。阳性细胞计数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；无着色0分，淡黄色1分，黄或深黄色2分，褐或棕褐色3分。

2结果

2.1实验动物数量分析实验过程中死亡9只，最终正常组22只，模型组16只，复荣通脉胶囊低剂量组15只，复荣通脉胶囊高剂量组16只。

2.2各组大鼠灌胃前后体质量变化情况各组大鼠灌胃前体质量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。灌胃8周后，正常组体质量明显高于灌胃前(P<0.05)，模型组和复荣通脉胶囊低剂量组、高剂量组体质量均明显低于灌胃前及正常组(P均<0.05)。见表1。

2.3各组大鼠灌胃前后血糖变化情况灌胃前模型组、复荣通脉胶囊低剂量组和高剂量组大鼠血糖水平均明显高于正常组(P均<0.05)；灌胃8周后，各组血糖水平与灌胃前相比差异均无统计学意义(P均>0.05)，模型组、复荣通脉胶囊低剂量组和高剂量组组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

2.4各组大鼠灌胃后血清TG、TC比较各组间TC比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，模型组TG明显高于正常组(P<0.05)，复荣通脉胶囊低剂量组、高剂量组TG与模型组和正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表1　各组大鼠灌胃前后体质量变化情况±s，g)

注：①与灌胃前比较，P<0.05；②与正常组比较，P<0.05。

表2　各组大鼠灌胃前后血糖变化情况±s，mmol/L)

注：①与正常组比较，P<0.05。

表3　各组大鼠灌胃后血清TG、TC比较

注：①与正常组比较，P<0.05。

2.5各组大鼠心肌组织中TGF-β1、CTGF表达情况TGF-β1在正常组大鼠心肌细胞胞质中呈弱阳性表达；模型组大鼠心肌细胞胞质及血管周围出现较多棕黄色颗粒物质，呈强阳性反应；复荣通脉胶囊高剂量组大鼠心肌细胞胞质及血管周围棕黄色颗粒较模型组大鼠明显较少、减弱，而复荣通脉胶囊低剂量组与模型组比较TGF-β1阳性表达未见明显减弱。CTGF在正常组大鼠心肌间质细胞及血管周围可见少许淡黄着色；模型组大鼠心肌间质细胞及血管平滑肌细胞可见大量棕黄色颗粒物质，呈强阳性反应；复荣通脉胶囊高剂量组大鼠心肌间质棕黄色物质较模型组明显减少、减弱，而复荣通脉胶囊低剂量组与模型组比较CTGF阳性表达未见明显变化。见图1～8及表4。

3讨论

TGF-β1是一种多效性细胞因子,其重要作用是调节细胞外基质的产生和降解。研究发现，在STZ诱导的糖尿病成模后6周血清和心肌局部的TGF-β1水平即明显增加，且随时间延长逐渐增高[4]。钟明等[5]研究发现糖尿病心肌病大鼠左室心肌组织胶原含量、TGF-β1蛋白质表达水平明显升高,存在心肌间质纤维化。经TGF-β1抗体干预后，TGF-β1的活性被抑制，转化生长因子水平及心肌胶原含量随之下降，心肌纤维化减轻[6]。显示TGF-β1参与了糖尿病心肌病心肌细胞肥大、心肌间质纤维化的发生、发展。

图1　正常组心肌组织中TGF-β1 表达情况(×400)

图2　模型组心肌组织中TGF-β1表达情况(×400)

图3　复荣通脉胶囊低剂量组心肌组织中TGF-β1表达情况(×400)

图4　复荣通脉胶囊高剂量组心肌组织中TGF-β1 表达情况(×400)

图5　正常组心肌组织中CTGF表达情况(×400)

图6　模型组心肌组织中CTGF表达情况(×400)

图7　复荣通脉胶囊低剂量组心肌组织中CTGF表达情况(×400)

图8　复荣通脉胶囊高剂量组心肌组织中CTGF表达情况(×400)

组别nTGF-β1CTGF正常组221.50±1.061.59±1.10模型组164.56±1.26①②4.44±1.36①②复荣通脉胶囊低剂量组154.47±1.19①②4.13±1.68①②复荣通脉胶囊高剂量组162.00±1.211.63±1.09

注：①与正常组比较，P<0.05；②与复荣通脉胶囊高剂量组比较，P<0.05。

CTGF是一种致纤维化生长因子。研究发现,在STZ诱导的糖尿病大鼠和小鼠心室中CTGF表达明显增高，并且随着病程的进展，CTGF 呈持续增高，细胞外基质蛋白、成纤维细胞合成的胶原蛋白增加，心肌细胞肥大，证明CTGF参与了糖尿病心肌病的发生、发展[7]。

中医学中并无“糖尿病心肌病”的病名，但根据其发病特点和常见证候，属中医“心悸”“怔忡”“胸痹”“厥心痛”等范畴。多数学者认为，“瘀”贯穿了其发生发展的全过程。复荣通脉胶囊方专为消渴心脉瘀阻、气阴不足而设，方中水蛭、全蝎、地龙化瘀、通络、熄风;黄芪、当归益气养血，补固正气；玄参、葛根养阴生津；川牛膝化瘀而引血下行；穿山龙活血而畅通经脉。该方补通结合，润活相滋，使正气存，邪气散，共达复荣通脉之功。

本实验结果显示，灌胃8周后，模型组大鼠体质量、血糖、血脂与复荣通脉胶囊高、低剂量组相比差异均无统计学意义，提示复荣通脉胶囊对糖尿病心肌病的治疗不是通过降低体质量、调节糖脂代谢发挥作用的。而复荣通脉胶囊高剂量组心肌组织中TGF-β1、CTGF表达水平明显低于模型组和复荣通脉胶囊低剂量组，提示复荣通脉胶囊能够下调TGF-β1、CTGF在糖尿病心肌组织的表达，从而发挥其对糖尿病心肌病的治疗作用，但具有剂量依赖性。在今后的实验中可将给药剂量进一步细化，以确定可达到预期疗效的剂量。

[参考文献]

[1]张林军，刘军. 补阳还五汤治疗2型糖尿病研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志，2012,18(1)：243

[2]金威尔，刘安. 加味补阳还五汤为主治疗增殖型糖尿病视网膜病变的临床研究[J]. 中国中医眼科杂志，2008,18(5):270

[3]徐淑云，卞如濂，陈修. 药理实验方法[M]. 北京：人民卫生出版社，2005：202

[4]李虎英，李兴. 转化生长因子β1在糖尿病心肌病变中作用的研究[J]. 临床医药实践，2007,16(4):266-268

[5]钟明,张运,苗雅,等. 缬沙坦逆转糖尿病心肌病大鼠心肌间质纤维化的作用[J]. 中华医学杂志,2006,86(4):232-236

[6]Bai S,Cao X. A nuclear antagonistic mechanism of inhibitor ySmadsin transforming growth factor-beta sig naling[J]. J Biol Chem，2002,277(6):4176-4182

[7]Kerrie J,Keiji I,Kiyoshi S,et al. Expression of connective tissue growth factor is increased in injured myocardium associated with proteinkinase C beta2 activation and diabetes[J]. Diabetes，2002,51(9):2709-2718

Experimental study on intervention effects of Furongtongmai capsule on the expression level of myocardial TGF-β1and CTGF in diabetic rats

QU Huiyun ,WANG Lixin

(Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Hebei Medical University, Cangzhou 061001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the intervention effects of Furongtongmai capsule on the expression level of myocardial TGF-β1 and connective tissue growth factor (CTGF) in diabetic rats, and to explore its possible mechanism on diabetic cardiomyopathy. Methods 88 male Wistar rats were randomly divided into four groups: normal control group (NC group), diabetic model control group(DM group), Furongtongmai capsule low-dose (FRL) and high-dose treated(FRH) groups with 22 rats in each group. The diabetic rat models were created by intraperitoneal injection of streptozocin(STZ) in all groups except NC group. After the models were successfully established, FRL group and FRH group were given Furongtongmai capsule 0.67 g/(kg·d) and 1.34 g/(kg·d) respectively by lavage, NC group and DM group were given normal saline by lavage. After treatment for 8 weeks, body weight (BW) was measured, blood glucose (BG), TC and TG were tested with automatic biochemical analyzer, and myocardial TGF-β1 and CTGF were detected by immunoshistochemistry assay. Results After 8 weeks, BW of the rats were higher in NC group while that in DM group and FRL and FRH groups were lower than those before lavage(P>0.05). No significant change of BG was found in every group compared with that before lavage (P>0.05). There was no significant difference in TC and BG among every group (P>0.05), but the level of TG was higher in DM group than that in NC group (P>0.05), no significant difference in TG was found between Furongtongmai capsule treatment groups and DM group(P>0.05). The expression level of TGF-β1 and CTGF in FRH group was lower than that in DM group and FRL group (P<0.05). Conclusion Furongtongmai capsule can down-regulate the expression of TGF-β1 and CTGF in myocardial tissue in DM rats, thus to play its treatment effect on diabetic cardiomyopathy, but dose dependence is also needed.

Key words:diabetic cardiomyopathy; Furongtongmai capsule; TGF-β1; connective tissue growth factor

[收稿日期]2015-10-10

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)14-1495-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.005

[作者简介]屈会云，女，硕士,从事中西医结合内分泌基础及临床研究工作。