右归丸对肾阳虚证患者TLR4/MyD88/NF-κB信号通路表达的影响

谭从娥，冯文哲，陈金妍，杨　飞

(陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046)



论著

右归丸对肾阳虚证患者TLR4/MyD88/NF-κB信号通路表达的影响

谭从娥，冯文哲，陈金妍，杨飞

(陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046)

[摘要]目的探讨右归丸治疗肾阳虚证的免疫调控机制。方法筛选9例肾阳虚证患者,均给予右归丸口服，连服1个月。分别于治疗前后采集患者外周静脉血，制备外周血单个核细胞(PBMC)，提取RNA，按照实时定量PCR(qPCR)实验流程，检测TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表达情况，并进行比较分析。结果治疗后，患者TLR4mRNA表达水平明显下调(P<0.05)，MyD88、NF-κB mRNA表达水平均明显上调(P均<0.05)。结论右归丸可以调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的表达，这可能是右归丸良性调节肾阳虚证免疫功能的分子机制之一。

[关键词]肾阳虚证；右归丸；TLR4/MyD88/NF-κB信号通路；实时定量PCR

肾阳虚证存在着免疫功能紊乱，这一结论已经被不同层次的实验研究所证实[1-2]。Toll受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路在自身免疫中有重要作用，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁[3]，与中医肾的免疫功能有着千丝万缕的联系。右归丸是临床治疗肾阳虚证最常用的代表方剂，其可通过调控免疫细胞、免疫基因以及细胞内信号传递通路等而发挥治疗作用[4]。因此笔者推测，对TLR信号通路的调节作用可能是右归丸良性调节肾阳虚证免疫功能失衡的分子机制之一。为了验证此假说，本研究通过实时定量PCR(qPCR)技术，分析TLR4介导的MyD88/NF-κB信号通路在肾阳虚证患者经右归丸治疗前后的表达情况，为右归丸良性调节肾阳虚证免疫功能失衡提供分子生物学证据。

1临床资料

1.1一般资料选择在陕西中医药大学附属医院男科门诊就诊且治疗显效的肾阳虚证患者9例，均无器质性疾病，年龄35～48(42.67±4.52)岁。中医临床表现以腰膝酸痛、畏寒肢冷、尺脉不足为主症，兼症有精神不振、性欲减退、腰背发冷、夜尿频多等，参照文献[5]所载肾阳虚证辨证因子评分细则，9例患者均具备主证4项，兼证3项以上，定性定量积分>18分，为典型的肾阳虚证。所有受试者均签署知情同意书，实验过程获得陕西中医药大学附属医院伦理委员会审批。

1.2试剂和仪器反转录试剂盒购自Fermentas公司，rTaq酶及配套试剂购自TAKARA公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix(DRR041A)购自TAKARA公司；普通PCR仪为ABI 9700型PCR扩增仪，定量PCR仪为ABI 7500 FAST型荧光定量PCR仪。

1.3方法

1.3.1治疗方法及疗效评定患者均给予右归胶囊(江西银涛药业有限公司生产，国药准字Z20030134，批号：1504014)口服，每次2粒，每天2次，空腹连服1个月。治疗前后分别按照肾阳虚证辨证因子评分细则对9例患者进行评分，治疗后证候积分减少≥70%为显效。积分减少率=(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分×100%。

1.3.2提取外周血单个核细胞(PBMC)分别于治疗前后采集患者外周血10 mL，EDTA抗凝，无菌条件下Ficoll液常规方法分离PBMC，每管加入0.5 mL Trizol试剂，充分抽打、混匀，置于-80 ℃以下冻存以备RNA的制备。

1.3.3qPCR法检测TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表达水平将纯化的PBMC,根据Trizol Regent 的操作步骤,提取总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性与纯度,要求能够清晰呈现28S、18S条带,OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间。取总RNA 20～50 μg，去除RNA基因组，按步骤合成cDNA第一链。采用SYBEGREEN qPCR法检测TLR4、MyD88及NF-κB mRNA表达水平，内参基因为18S rRNA。PCR引物信息见表1。参照说明书设定PCR程序，95 ℃10 min变性，然后95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，重复40个循环进行扩增。反应结束，设定最佳阈值，获取Ct(threshold cycle)值，根据仪器给出的标准曲线和斜率，获得目的基因的相对表达指数。

表1　各目的基因的引物序列及产物大小

注：①为内参照基因。

1.4统计学方法数据采用SPSS 15.0统计软件进行处理，结果以表示。采用相对定量法[6]分析各目的基因mRNA相对表达水平。以18S rRNA作为内参照基因，计算各目的基因在每个样本的ΔCt(ΔCt = Ct目的基因-Ct18S rRNA)值，采用配对t检验方法比较各目的基因mRNA治疗前后表达差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各样本RNA质控图各样本提取出的RNA经紫外分光光度计测定吸光度，每个样品OD260/OD280均>1.7，RNA经琼脂糖凝胶电泳显示28S和18S条带清晰，质检结果合格。电泳图见图1。

图1　治疗前后各样本RNA电泳图

2.2扩增曲线和溶解曲线通过对TLR4、MyD88、NF-κB及管家基因18S rRNA的溶解曲线分析发现，每条目的基因都有单一的Tm(DNA溶解温度)值，相应地出现一个单一的吸收峰，表明实验中PCR产物的均一性良好，各基因的扩增具有特异性。扩增曲线及溶解曲线见图2～9。

图2　18S的扩增曲线

图4　TLR4的扩增曲线

图5　TLR4的溶解曲线

图6　MyD88的扩增曲线

图7　MyD88的溶解曲线

图8　NF-κB的扩增曲线

图9　NF-κB的溶解曲线

2.3治疗前后各通路基因mRNA的表达差异治疗后，患者TLR4mRNA表达水平明显下调(P<0.05)，MyD88、NF-κBmRNA表达水平均明显上调(P均<0.05)。见表2。

表2　治疗前后各目的基因mRNA相对

注：①与治疗前比较，P<0.05。

3讨论

肾为先天之本，正气之根，决定先天禀赋的强弱，关系到正气的盛衰，具有调整和维持机体免疫平衡的重要作用。肾蕴涵肾阴和肾阳，二者协调平衡，则处于“阴平阳秘”状态，表现为机体的自我调节能力、适应环境能力、抗邪防病能力和康复自愈能力等的正常。这和强调人体“防御、自稳和监视”三大功能的现代医学免疫理论是一致的。如果肾阳亏虚，阴阳失调，则机体的免疫稳态失衡。免疫稳态的维持需要一系列免疫分子的信息传递和整合，信号通路则是实现这些生物学过程的重要路径。TLR/MyD88通路是一条介导天然免疫反应的重要信号转导通路。因此，借助经典免疫信号通路TLR4介导的MyD88/NF-κB信号通路研究和肾阳虚证方证相应的右归丸的疗效机制具有确切的理论依据。

选择典型病例是影响实验结果的关键因素之一。在临床病例的采集中，本研究采取了肾阳虚证四诊症状调查表计分和专家诊断相结合的方法，首先根据肾阳虚证辨证因子评分量表在门诊对患者进行调查表计分初筛，然后再由中医临床专家诊断确定并跟踪观察右归丸临床疗效。经过疗效评定筛选了9例达到显效的患者作为qPCR实验检测对象，结果发现，治疗后患者TLR4mRNA表达水平明显下调，MyD88、NF-κB mRNA表达水平均明显上调，提示右归丸可以调控肾阳虚证TLR4/MyD88/NF-κB通路基因的表达。

生物体内的信息传递和整合是由细胞内外的受体和信号转导系统来完成的，不同的信号通路之间存在相互的联系和作用[7]。TLR/MyD88通路是一条介导天然免疫反应的重要信号转导通路，TLRs激活后通过依赖MyD88和非依赖MyD88信号转导途径,最终引起核因子NF-κB活化、炎性反应因子分泌增加[8]。研究证明该通路的异常与肾阳虚证的发生发展密切相关[9]。本研究通过对肾阳虚证经右归丸治疗前后该通路基因的表达比较，也证实了此结论，说明肾阳虚证存在着免疫功能紊乱，且右归丸可以纠正肾阳虚证免疫紊乱状态，而对TLRs信号通路的调节作用可能是这种纠正作用的分子机制之一。本研究从免疫信号通路角度揭示了右归丸对肾阳虚证的调控机制，为右归丸治疗肾阳虚证的宏观疗效提供了理论依据。

[参考文献]

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[4]谭从娥，王米渠. 右归丸对肾阳虚证患者干预效应的差异表达基因功能网络分析[J]. 中成药,2013,35(9):1875-1879

[5]严石林,高锋,吴斌,等. 肾阳虚证半定量化操作标准的研究[J]. 现代中西医结合杂志,2004,13(6):701-702

[6]Schmittgen TD,Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J]. Nature Protocol,2008,3(6):1101-1108

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[8]Hasan U，Chaffois C，Gaillard C，et al. Human TLR10 is a functional receptor，expressed by B cells and plasmacytoid dendritic cells, which activates gene transeription through MyD88[J]. J Immunol，2005，174(5):2942-2950

[9]沈自尹. 以药测证对肾虚证基因网络和信号转导的研究[J]. 中国中西医结合杂志,2005,25(12):1125-1128

Effect of Yougui Pills on TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway of patients with Kidney-Yang deficiency syndrome

TAN Conge，FENG Wenzhe,CHEN Jinyan,YANG Fei

(Shaanxi University of TCM, Xianyang 712046, Shaanxi, China)

Abstract:Objective It is to discuss the immune regulation mechanism of Yougui Pills on the Kidney-Yang deficiency syndrome. Methods Nine Kidney-Yang deficiency patients were selected for one month treatment with Yougui Pills. Accumulated clinical scores of Kidney-Yang deficiency were assessed pre-treatment and post-treatment using a 40-factor questionnaire. Nine patients were all observed with good therapeutic efficacy and were prepared for Real-time Quantitative PCR (qPCR) tests. 10mL blood were collected to tract Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) for each patients pre-treatment and post-treatment with Yougui Pills. With the RNA from PBMC, we did qPCR tests to detect mRNA expressed value of three target genes of TLR4, MyD88 and NF-κB. Results TLR4, MyD88 and NF-κB genes of Kidney-Yang deficiency patients were significantly expressed after treated by Yougui Pills, the TLR4 gene was down regulated while the MyD88 and NF-κB gene was up regulated. Conclusion Yougui Pills could regulate the expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway, which may be one of the molecular mechanisms for Yougui Pills to regulate the immune function of Kidney-Yang deficiency syndrome.

Key words:Kidney-Yang deficiency syndrome; Yougui Pill; TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway; real-time quantitative PCR

[收稿日期]2015-12-30

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)14-1483-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.001

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(81473559)；陕西省教育厅自然科学专项课题(2013JK0821)；咸阳市科技局项目(2012K16-02)

[作者简介]谭从娥，女，副教授，从事中医诊断学研究。