血府逐瘀汤对心肌梗死大鼠心肌发育相关基因GATA4、NKx2.5调控作用的研究

周　菁，张　焱，张　倩，邓中龙，朱岩峰

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437)



血府逐瘀汤对心肌梗死大鼠心肌发育相关基因GATA4、NKx2.5调控作用的研究

周菁，张焱，张倩，邓中龙，朱岩峰

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437)

[摘要]目的观察血府逐瘀汤对心肌梗死大鼠心肌发育相关基因GATA4、NKx2.5的调控作用。方法采用结扎大鼠左冠状动脉前降支方法建立心肌梗死模型，将成模大鼠随机分为模型组和血府逐瘀汤组，每组30只。另选择同月龄健康SD大鼠10只作为假手术组。模型组给予生理盐水2 mL/次灌胃，血府逐瘀汤组给予浓煎血府逐瘀汤2 mL/次灌胃，均1次/d。采用RT-PCR方法检测3组大鼠干预1 d、10 d、15 d心肌组织中GATA4、Nkx2.5mRNA表达水平。结果干预1d后，模型组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量均明显低于假手术组(P均<0.05)；干预10 d后，模型组和血府逐瘀汤组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量与假手术组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，但模型组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量和血府逐瘀汤组GATA4mRNA表达量均明显高于干预1 d后(P均<0.05)；干预15 d后，血府逐瘀汤组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量均明显高于假手术组(P均<0.05)。干预1 d、10 d、15 d后，血府逐瘀汤组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量均较模型组有所升高，但差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论大鼠心肌梗死后，其心肌组织中GATA4、Nkx2.5mRNA表达量呈现先下降、再升高的趋势。血府逐瘀汤可发挥一定的促进心肌梗死大鼠心肌发育相关基因GATA4、NKx2.5表达增加的作用，该作用可能是祛瘀中药促进梗死后心肌组织迅速修复、愈合的机制之一。

[关键词]血府逐瘀汤；心肌梗死；GATA4；Nkx2.5

我国目前联用西药及中药综合治疗冠心病心肌梗死的方案很普遍。冠心病心肌梗死相当于祖国医学“胸痹心痛”“真心痛”范畴，而“胸痹心痛”“真心痛”以血瘀、痰浊作为标实的特点已得到广泛认可。临床上中医药专家针对冠心病“真心痛”的防治多从祛瘀化痰着手，且取得较好临床疗效[1-3]，但有关祛瘀中药对梗死后心肌发育相关基因调控作用的实验研究却相对较少。本研究选用《医林改错》记载之血府逐瘀汤为代表方，观察了该方对急性心肌梗死大鼠心肌组织中心肌发育相关基因GATA4、NKx2.5mRNA表达的影响，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1动物雄性SD大鼠70只，清洁级，体质量(250±20)g。北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：11400700038123。

1.2药物血府逐瘀汤，组方：当归9 g、生地9 g、 桃仁12 g、红花9 g、枳壳6 g、赤芍6 g、柴胡3 g、甘草3 g、桔梗4.5 g、川芎4.5 g、牛膝10 g。自动煎药机统一煎药，控制时间及加水量，浓煎至生药含量为1 g/mL。

1.3试剂及仪器Trizol(Invitrogen)；二乙基焦碳酸酯(DEPC，国药)；引物合成(Invitrogen)；无水乙醇、氯仿、灭菌的DEPC 水、PCR master mix、逆转录试剂盒等(Biotnt)。微型离心机，GyroSpin(GYROZEN)；旋涡混合器，GL-88B(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；恒温金属浴，HB-100(杭州博日科技有限公司)；qPCR仪，ViiA7(life technology(ABI))；离心机，TDL-80-2B(飞鸽牌)；超细匀浆器，F6/10-6G(FLUKO(上海)流体机械制造有限公司)；移液器，10 μL/200 μL /1 000 μL(Dragonlab)。

1.4造模及给药方法参考文献[4-5]报道的造模方法，结扎大鼠左冠状动脉前降支。结扎前后记录Ⅱ导联心电图，以结扎部位以下心肌变苍白、搏动减弱且出现J点明显抬高为造模成功。术后将存活大鼠随机分为模型组和血府逐瘀汤组，每组30只。另选取预留的10只健康雄性SD大鼠作为假手术组。模型组给予生理盐水2 mL/次灌胃，血府逐瘀汤组给予血府逐瘀汤2 mL/次灌胃，均1次/d。

1.5心肌组织中GATA4、Nkx2.5mRNA检测方法分别于干预1 d、10 d、15 d后每组各处死10只大鼠，取心肌组织，以β-actin为内参，从心肌组织中提取总RNA。以提取出的mRNA进行逆转录，成为cDNA模板进行RT-PCR实验。扩增条件95 ℃ 5 min→95 ℃ 15 s→ 60 ℃ 30 s(读荧光)→95 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s(0.3 ℃/s)；95 ℃ 15 s，共进行40个循环。

2结果

干预1 d后，模型组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量均明显低于假手术组(P均<0.05), 血府逐瘀汤组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量有低于假手术组的趋势，但差异无统计学意义(P均>0.05)；干预10 d后，模型组和血府逐瘀汤组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量与假手术组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，但模型组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量和血府逐瘀汤组GATA4mRNA表达量均明显高于干预1 d后(P均<0.05)；干预15 d后，血府逐瘀汤组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量均明显高于假手术组(P均<0.05)。干预1 d、10 d、15 d后，血府逐瘀汤组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量均较模型组有所升高，但差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1　各组大鼠干预后不同时间点GATA4、NKx2.5mRNA表达量比较

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与干预1d比较，P<0.05。

3讨论

急性心肌梗死是在冠状动脉粥样硬化病变狭窄的基础上由急性血栓形成而导致血管闭塞，使心肌严重而持久缺血坏死的一种疾病。从中医角度来讲，急性心肌梗死的发生过程类似出现了瘀血内停、瘀滞不通的血瘀证，治宜活血化瘀。大多数专家推崇以“祛瘀生新”为治疗指导原则，然而有关其“祛瘀”及“生新”的具体作用环节，现代实验研究还不够详尽。张金生[6]认为“生新”层面包含“生新血、生新物、生新脉、化旧生新”4个方面。其中“生新物”是受损脏器“真气”复生的过程，先天之精是新物再生的物质基础。其提出活血化瘀的“生新”是机体“复其真气”之新。而作为心肌梗死后的心肌细胞再生，也需要机体“真气修复”。因此，针对梗死后的心肌组织，从调控心肌细胞发育的基因层面来研究将是很有启发的。

Linke等[7]研究认为激活心脏原始细胞可显著促进梗死后受损组织的修复，而心肌发育相关基因GATA4和Nkx2.5在促使心脏原始细胞分化成心肌细胞中起重要作用。国内有研究发现，在正常心肌中，基因GATA4、Nkx2.5有较强的表达；心肌梗死后，GATA4、Nkx2.5表达下降，7 d后又有所恢复[8]。体外实验表明，Nkx2.5基因的表达可以启动心肌的发生[9]。心肌梗死后，有Nkx2.5表达阳性的干细胞迁移到梗死灶，并且分化为心肌细胞[10]。这些研究说明心肌中Nkx2.5表达阳性的干细胞具有向心肌细胞分化的潜能。此外，Heineke等[11]研究发现，在鼠类心脏中特异性高表达GATA4可以增加心肌毛细血管和小血管密度，增强冠脉流量储备和冠脉灌注依赖的心肌收缩力，提示GATA4可调控冠脉血管生成。GATA4还可以激活p19细胞的Nkx2.5启动子。Nkx2.5和GATA4可协同作用诱导心肌分化[12]。

本研究结果发现，在急性心肌梗死后第1天，模型组大鼠GATA4、Nkx2.5mRNA表达水平均显著下降，并在10 d后升高，提示心肌梗死可激活GATA4、Nkx2.5表达，与文献[8]报道相符；予以血府逐瘀汤干预1 d、10 d、15 d后，大鼠心肌组织中的GATA4、Nkx2.5mRNA表达量均升高，虽然与模型组相比差异无统计学意义，但仍提示血府逐瘀汤可能对梗死后大鼠的心肌发育相关基因GATA4、Nkx2.5表达具有正性促进作用。GATA4、Nkx2.5表达的增加在促使心脏原始细胞分化成心肌细胞及增加心肌毛细血管和小血管密度、调控冠脉血管生成中起到一定的作用，提示血府逐瘀汤可能是通过上调GATA4、Nkx2.5的表达来促进梗死后心肌组织迅速修复、愈合的。此外，本实验结果也提示下一步可能需要通过适当延长血府逐瘀汤的干预时间或通过扩大样本量来连续观察梗死后大鼠心肌发育相关基因GATA4、Nkx2.5的表达趋势，以获得更有意义的实验结果，为丰富中医“祛瘀生新”的理论内涵提供机制支持。

[参考文献]

[1]万雪原，刘桂鸾，王淑芳. 血府逐瘀汤治疗急性心肌梗死后心绞痛34例疗效观察[J]. 河北中医，2000，28(11)：28-29

[2]高会丽，李贻奎，仝燕，等. 冠心Ⅱ号系列方对大鼠心肌梗死的实验研究[J]. 陕西中医，2008，29(2)：231-233

[3]方居正. 活血化瘀法对急性心肌梗死病人血清前胶原蛋白Ⅲ的影响[J]. 中国中医药现代远程教育，2009，7(7) ：9-10

[4]袁肇凯. 中医诊断实验方法学[M]. 2版. 北京:科学技术出版社，2006：257

[5]汪进益，范慧敏，刘中民. 建立适用于细胞移植研究的大鼠心肌梗死动物模型[J]. 上海医学，2007，30(增刊)：63

[6]张金生. 活血化瘀治法理论“祛瘀血”和“生新”层面的内涵探究[J]. 北京中医药大学学报,2012,35(4):230-232

[7]Linke A,Müller P,Nurzynska D,et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(25):8966-8971

[8]姜涛，王春梅，来仪. 大鼠心肌发育相关基因在心肌梗死后的表达变化[J]. 中国生物化学与分子生物学报，2004，20(6) ：833-837

[9]Dai YS，Cserjesi P，Markham BE，et al. The transcription factors GATA4 and dHAND physically interact to synergistically activate cardiac gene expression through a p300-dependent mechanism[J]. J Biol Chem，2006，277(27)：390-398

[10] Takei S,Ichikawa H,Johkura K,et al. Bone morphogenetic protein-4 promotes induction of Cardiomyocytes from human embryonic stem cells in serum-based embryoid body development[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(6)：H1793-H1803

[11] Heineke J，Auger Messier M，Xu J，et al. Cardiomyocyte GATA4 functions as a stress-responsive regulator of angiogenesis in the murine heart[J]. J Clin Invest，2007，117(11) ：3198-3210

[12] 王晶晶，赵瑞庆，李海荣. 转录因子GATA4与原始心管的形成和静脉端的发育[J]. 解剖学杂志，2009，32(4)：437-441

Regulatory effect of Xuefu Zhuyu decoction on GATA4 and NKx2.5 in rats after myocardial infarction

ZHOU Jing, ZHANG Yan, ZHANG Qian, DENG Zhonglong, ZHU Yanfeng

(Yueyang Hospital of Integrative Chinese & Western Medicine Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200437, China)

Abstract:Objective It is to explore the regulatory effect of Xuefu Zhuyu decoction on gene GATA4 and NKx2.5 in rats after myocardial infarction. Methods The left anterior descending coronary arteries of SD rats were ligated to establish rat models of myocardial infarction. All rats with myocardial infarction were divided into model group (n=30) and Xuefu Zhuyu decoction group (n=30).Anther 10 rats were selected as sham group (n=10).The rats in control group were treated with 2mL of 0.9% NaCl per day. The rats in Xuefu Zhuyu decoction group were treated with 2 mL of concentrated decoction per day. Treatment duration was also altered. There were three different duration of treatments specifically 1 day, 10 days, and 15 days. The levels of GATA4, Nkx2.5mRNA in myocardium were detected by RT-PCR. Results On the 1st day after myocardial infarction, the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in myocardial infarction model group were significantly decreased compared to those in the sham group (P<0.05). On the 10th day after myocardial infarction,the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in model group and Xuefu Zhuyu decoction group were not significantly increased compared to those in the sham group (P>0.05), but the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in model group and the expression of GATA4mRNA in Xuefu Zhuyu decoction group on the 10th day were significantly increased compared to those in the sham group on the 1st day (P<0.05). On the 15th day after myocardial infarction,the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in Xuefu Zhuyu decoction group were significantly increased compared to those in the sham group (P<0.05). On the 1st, 10th and 15th day after myocardial infarction, the expression of GATA4mRNA and Nkx2.5mRNA in Xuefu Zhuyu decoction group were increased compared to those in the myocardial infarction model group, but there was not significant difference between the two groups(P>0.05).Conclusion Xuefu Zhuyu decoction may have a regulatory effect on gene GATA4 and NKx2.5 in rats after myocardial infarction and this effect may be one of the genetic basis of accelerated myocardial cell repair.

Key words:Xuefu Zhuyu decoction; myocardial infarction; GATA4; Nkx2.5

[收稿日期]2016-01-05

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)14-1486-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.002

[基金项目]国家自然科学基金(青年基金)资助项目(81202668)

[作者简介]周菁，女，中医学博士，主治医师，主要从事中西医结合防治冠心病的研究。