紫花地丁止痒复方提取工艺的优化

曾海荣， 赵　振， 梁美云， 姚雅绮， 王　冰， 张伟荣

（上海中医药大学，上海201203）



紫花地丁止痒复方提取工艺的优化

曾海荣， 赵振， 梁美云， 姚雅绮， 王冰*， 张伟荣*

（上海中医药大学，上海201203）

摘要：目的 优化紫花地丁止痒复方的提取工艺。方法 采用L9（34）正交试验，考察浸泡时间、加水量、提取时间3个因素对提取工艺的影响，HPLC法测定秦皮乙素含有量，以秦皮乙素转移率和干膏得率为指标进行综合评价。结果 最优工艺为浸泡30 min，加入10倍量水，提取2次，每次1 h，秦皮乙素含有量为5.90 mg/g，转移率为58.60％。结论 该提取工艺合理，操作简单，样品质量稳定，对紫花地丁止痒复方质量控制具有参考意义。

关键词：紫花地丁止痒复方；提取工艺；秦皮乙素；正交试验；HPLC法

紫花地丁止痒复方由紫花地丁、苦参、白鲜皮3味中药组成，是本校经多年使用证明疗效确切的临床验方，该组方简单，疗效显著，主要用于湿疹、荨麻疹和皮肤瘙痒症等临床皮肤病的治疗。方中紫花地丁性味苦寒，归心、肝经，功效清热解毒，消痈散疖，为君药，其主要含有香豆素类成分［1］，而秦皮乙素为其有效成分和特征成分［2］，具有抗炎［3］、抗氧化［4］、抗菌、抗病毒等药理作用［5］；臣以苦参，因其性味苦寒，善祛风、杀虫止痒，为诸多皮肤病所常用；白鲜皮性味苦寒，善清热燥湿、解毒、祛风止痒，为治疗皮肤湿疹、湿疮、疥癣等疾病的常用药。本实验参考文献［6-10］，采用正交试验方法，考察浸泡时间、加水量、提取时间对复方中秦皮乙素转移率和干膏得率的影响，优选最佳提取工艺，为紫花地丁止痒复方的提取、质量控制及开发利用提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，配有四元恒流泵、在线脱气机、VWD检测器（美国Agilent公司）；AT201型电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；TC-6K型电子天平（美国双杰兄弟有限公司）；Milli-Q型纯水器（美国Millipore公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；调温电热器（通州市申通电热器厂）；Rotavapor旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；SHB-IIIA型循环水式多用真空泵（南京科尔仪器设备有限公司）。

1.2 药品与试剂 紫花地丁（批号141118-201411）、苦参（批号141006-201410）、白鲜皮（批号140821-201408）药材购自上海康桥中药饮片有限公司；秦皮乙素（批号GR-133-140408）对照品购自上海伊洪生物化学有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯（沃凯公司）；磷酸为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 HPLC法分析提取物中的秦皮乙素

2.1.1 溶液的制备

2.1.1.1 对照品溶液 精密称取秦皮乙素对照品4.54 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，配成454 μg/mL贮备液。然后，将其依次稀释成227.0、113.5、56.75、28.36、14.19、7.090、3.550 μg/mL系列对照品溶液。

2.1.1.2 供试品溶液 精密称取干燥提取物粉末0.02 g，加甲醇溶解，称定质量，超声溶解15 min，甲醇补足减失质量，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 测定波长的选择 将秦皮乙素贮备液稀释5倍，紫外分光光度计进行全波长扫描（200～600 nm），最终选择最大吸收波长为348 nm。

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 色谱条件［11-16］Ultimate XB-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相乙腈-0.1％磷酸水（18∶82），等度洗脱；检测波长348 nm；体积流量1 mL/min；柱温25℃；进样量10 μL，色谱图见图1。

1.秦皮乙素图1　HPLC色谱图

2.1.3.2 标准曲线的制备 取“2.1.1.1”项下对照品溶液，在“2.1.3.1”项色谱条件下测定。以峰面积平均值为纵坐标（Y），对照品质量浓度（μg/mL）为横坐标（X）进行回归，得到线性方程Y=44.287X+61.492，r=0.999 9，表明秦皮乙素在3.55～227 μg范围内线性关系良好。

2.1.3.3 精密度与稳定性试验 在“2.1.3.1”项色谱条件下，精密吸取“2.1.1.1”项下对照品溶液10 μL，连续进样5次，测得峰面积RSD为0.76％，表明仪器精密度良好。然后，分别于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取“2.1.1.2”项下供试品溶液10 μL，测得峰面积RSD为0.97％，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.3.4 重复性试验 取同一提取物适量，按“2.1.1.2”项下方法平行制备5份供试品溶液，在“2.1.3.1”项色谱条件下测定。结果，秦皮乙素含有量为5.55 mg/g，RSD为0.18％，表明该方法重复性良好。

2.1.3.5 加样回收率试验 精密称取秦皮乙素含有量已知（5.55 mg/g）的提取物粉末9份，精密加入对照品溶液（0.454 mg/mL）适量，按“2.1.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3.1”项色谱条件下测定，结果见表1。

表1　加样回收率试验结果

2.2 正交试验 按照处方，分别称取紫花地丁30 g、白鲜皮15 g、苦参15 g，加适量水浸泡一段时间，煎煮提取，浓缩，冷冻干燥，即得提取物。

2.2.1 试验设计因素水平安排 根据预实验单因素考察结果，发现提取2次的效果较佳，故采用L9（34）正交试验设计表对复方提取工艺进行优选，以浸泡时间（A）、加水量（B）、提取时间（C）为考察因素，每个因素选取3个水平，结果见表2。

表2　因素水平

2.2.2 提取方法与结果分析 按处方称取紫花地丁、苦参、白鲜皮药材适量，根据正交设计条件提取2次，合并提取液，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥，按“2.1.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3.1”项色谱条件下测定，计算秦皮乙素转移率和干膏得率［17］，结果见表3，方差分析见表4。

直观分析显示，3个因素的影响程度依次为B>A>C，最佳工艺条件为A2B2C1。由于因素C的离差平方和小于误差项因素D，故将其并入误差项计算。方差分析表明，加水量（B）影响最显著（p<0.05），选择B2，而浸泡时间（A）和提取时间（C）均无显著性影响（p>0.05），故可根据生产实际情况作适当调整。最终，优选的工艺条件为浸泡30 min，加10倍量水，提取2次，每次1 h。

2.2.3 验证试验 称取紫花地丁30 g、白鲜皮15 g、苦参15 g，共3份，按最佳工艺条件进行验证试验，在“2.1.3.1”项色谱条件下测定。结果，秦皮乙素含有量为5.90 mg/g，RSD为1.35％，转移率为58.60％，表明该工艺稳定可靠。

表3　L9（34）正交设计结果

3 讨论

单因素试验表明，2次提取比1次提取可转移出更多的秦皮乙素，故从实验需要及节约能源角度考虑，选择2次提取；正交试验显示，加水量为影响最显著的因素。紫花地丁为叶类药材，易吸收水分，在预实验中发现，第一次加8倍量水时，紫花地丁容易黏壁，不利于提取；加10倍量水时，提取效果较好，与正交试验的优选结果一致。

现代药理研究表明，紫花地丁的主要有效成分为黄酮类和香豆素类化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等作用［18-20］，而香豆素类成分秦皮乙素是其有效成分和特征成分之一。由于该成分转移率和干膏得率是评价水提工艺的关键指标，故本实验以两者综合评分来优选复方水提工艺，表明其合理可行，可为紫花地丁止痒复方的临床应用及开发提供参考。

参考文献：

［1］ 陈胡兰，董小萍，张 梅，等.紫花地丁化学成分研究［J］.中草药，2010，41（6）：874-877.

［2］ 梁承远，张诗韵，毛跟年，等.秦皮乙素及其衍生物的合成与药理学研究进展［J］.陕西科技大学学报，2015，33 （2）：126-133.

［3］ 李艳丽，胡彦武.紫花地丁抗炎作用及机制研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（24）：244-247.

［4］ 曹 捷，秦 艳，尹成乐，等.紫花地丁化学成分及抗氧化活性［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（21）：77-81.

［5］ 李永生，何希瑞，杨 燕，等.紫花地丁化学成分与药理活性研究新进展［J］.环球中医药，2013，6（4）：313-318.

［6］ 王艳平，夏新华，王杰英.正交试验法优选紫蒲颗粒提取工艺的研究［J］.中成药，2009，31（1）：133-134.

［7］ 蔡 皓，庄延双，刘 晓，等.正交优选小柴胡汤的提取工艺［J］.中药材，2012，35（12）：2036-2039.

［8］ 徐静静，艾训儒，李 琴，等.正交试验优选延龄草多糖提取工艺研究［J］.中药材，2013，36（2）：305-307.

［9］ 刘惠英.正交试验优化香砂养胃片处方的研究［J］.中药材，2012，35（3）：491-493.

［10］ 巨建云，赵海霞.水提取法制备苦参配方颗粒的工艺研究［J］.中药材，2009，32（10）：1625-1627.

［11］ 宁火华，艾其茂，罗跃华.HPLC测定紫花地丁中秦皮乙素的含量［J］.中国药品标准，2007，8（3）：68-69.

［12］ 王甫成，夏成凯，栗进才，等.HPLC同时测定紫菀中5种黄酮类成分［J］.中成药，2012，34（2）：306-309.

［13］ 陈胡兰，汤沛然，张 梅，等.不同产地紫花地丁中秦皮乙素的含量比较［J］.成都中医药大学学报，2010，33 （3）：72-96.

［14］ 涂瑶生，胥爱丽，江洁怡，等.紫花地丁配方颗粒的HPLC指纹图谱研究［J］.广东药学院学报，2013，29（4）：388-391.

［15］ 林夏楠，林巧之.紫花地丁中秦皮乙素含量测定研究［J］.海峡药学，2008，20（9）：60-62.

［16］ 陈胡兰，汤沛然，张 梅，等.紫花地丁药材及其混淆品的HPLC指纹图谱研究［J］.中国药学杂志，2010，45 （18）：1372-1375.

［17］ 王 宁，陈晓斌，刘志辉，等.热痹消颗粒提取纯化工艺研究［J］.中成药，2011，33（11）：2003-2005.

［18］ 李艳丽，胡彦武.紫花地丁抗炎作用及机制研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（24）：244-247.

［19］ 孙艺方，杜利利，周 乐，等.紫花地丁抗菌活性成分研究［J］.中国中药杂志，2011，36（19）：2666-2670.

［20］ 徐金钟，曾珊珊，瞿海斌.紫花地丁化学成分研究［J］.中草药，2010，41（9）：1423-1425.

*通信作者：王 冰（1974—），女，博士，副教授，从事中药纳米制剂研究。E-mail：annabel_ cn@163.com张伟荣（1953—），男，硕士，教授，从事中医临床与教学研究。E-mail：zwr885@126.com

作者简介：曾海荣（1990—），男，硕士生，从事心血管药理与炎症医学研究。E-mail：hr2323631@126.com

基金项目：国家自然科学基金（81303233）

收稿日期：2015-08-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.047

中图分类号：R284.2

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）05-1174-03