基于Keap1-Nrf2-ARE通路维持黏膜屏障完整探讨舒胃汤防治胃溃疡的研究

张　琪，梁海业，陈世新，张　涛

(1. 广西桂平市中医医院，广西 桂平 537200；2. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011)



基于Keap1-Nrf2-ARE通路维持黏膜屏障完整探讨舒胃汤防治胃溃疡的研究

张琪1，梁海业1，陈世新1，张涛2

(1. 广西桂平市中医医院，广西 桂平 537200；2. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011)

[摘要]目的通过观察胃溃疡患者治疗前后Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-核转录相关因子2-抗氧化反应元件(Keap1-Nrf2-ARE)通路中相关指标及胃黏膜超微结构变化，探讨舒胃汤防治胃溃疡可能机制。方法采用自身前后历史对照设计，选择符合诊断标准、纳入标准及排除标准的胃溃疡患者30例，予舒胃汤连续干预6周，应用透射电镜观察治疗前后胃黏膜超微结构及上皮细胞凋亡情况，应用荧光定量PCR技术检测Keap1、Nrf2、ARE基因表达情况，应用免疫组化法检测ZO-1及Occludin蛋白表达情况。结果治疗前，电镜下可见胃黏膜上皮细胞微绒毛稀疏甚至脱落消失，细胞间复合连接松解消失，核固缩，出现核周隙，异染色质块状分布于核膜下；线粒体肿胀变大，嵴断裂；粗面内质网扩张，细胞处于坏死期，存在细胞大量自噬现象。治疗后，电镜下可见胃黏膜上皮细胞体积明显变小，核染色质边集、核固缩，核膜断核碎裂，细胞器明显扩张肿胀、碎裂，空泡化，凋亡小体形成，亦存在细胞自噬现象。治疗后，患者胃黏膜组织中Keap1、Nrf2、ARE表达水平，ZO-1及Occulidin蛋白阳性分布面积均明显高于治疗前(P均<0.05)。结论舒胃汤可能通过调控Keap1-Nrf2-ARE通路，减少氧化应激损伤，上调ZO-1及Occludin蛋白表达，促进黏膜屏障修复而发挥防治胃溃疡的作用。

[关键词]Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1；核转录相关因子2；氧化反应；黏膜屏障；胃溃疡；舒胃汤

现阶段，“提高黏膜愈合质量，减少溃疡复发”是消化性溃疡防治的重要目标[1]。前期课题组在广西卫生厅课题资助下初步证实舒胃汤具有明确防治消化性溃疡的临床效用，与四联疗法联用可提高幽门螺杆菌根除率及黏膜愈合质量，其机制可能与延缓上皮细胞凋亡，上调基质金属蛋白酶-3及Ghrelin表达相关[2-4]。尽管目前“无酸则无溃疡”理念已被广泛接受，但是不可否认免疫相关损伤以及氧化应激产生的活性氧(ROS)直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，均可导致胃黏膜屏障破坏及胃黏膜修复障碍，引起靶器官损伤。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-核转录相关因子2-抗氧化反应元件通路(Keap1-Nrf2-ARE)调节抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达，介导ZO-1及Occludin蛋白释放，对维持胃黏膜紧密连接具有重要作用[5-6]，课题组基于前期工作基础，采用自身前后历史对照设计，观察了舒胃汤治疗前后胃黏膜超微结构、Keap1-Nrf2-ARE通路中相关指标及ZO-1蛋白、Occludin蛋白表达情况，旨在探讨舒胃汤防治胃溃疡的可能机制。

1临床资料

1.1一般资料选择2014年1月—2015年1月在桂平市中医医院消化内科门诊就诊胃溃疡患者30例，均符合《中医内科常见疾病诊疗指南·西医疾病部分》中消化性溃疡辨证分型章节关于肝胃郁热诊断标准[7]，均为单纯性胃溃疡，无并发症，年龄18～65岁，能理解和签署知情同意书。排除有严重肝肾功能不全、心肺功能不全及精神疾病患者，孕妇或近3个月有意怀孕者。其中男14例，女16例；年龄(37.23±11.16)岁；病程(2.45±1.12)个月。

1.2试剂与仪器Olympus内镜操作系统(260)，电镜固定液、10%中性福尔马林购自上海玉森生物试剂公司，Keap1、Nrf2及ARE引物设计与合成委托广州蓝吉生物技术有限公司，ZO-1、Occludin蛋白一抗购自美国Santa公司，二抗购自武汉博士德公司。ABI7500荧光定量PCR仪、H-600透射电镜以及低温高速离心机均由广州蓝吉生物技术有限公司提供。Keap1、Nrf2、ARE及GAPDH引物序列见表1。

1.3治疗方法采用自身前后历史对照设计，所有患者均给予舒胃汤口服。组方：柴胡10 g、白芍12 g、枳壳10 g、甘草6 g、厚朴10 g、砂仁6 g、蒲公英15 g、石斛15 g、郁金12 g、川楝子6 g、延胡索12 g、芦根15 g。均为免煎中药，购自本院药房，由江苏江阴天江制药有限公司生产。每天1剂，分2次服，连续6周。

表1　Keap1、Nrf2、ARE及GAPDH引物序列

注：在Gen Bank上查找目的基因mRNA序列，在CDS区设计特异性引物。

1.4观察指标

1.4.1胃黏膜超微结构及上皮细胞变化分别于治疗前后采用透射电镜(H-600)观察胃黏膜超微结构及上皮细胞凋亡、坏死及自噬情况，实验步骤严格按照电镜操作说明进行。

1.4.2胃黏膜Keap1-Nrf2-ARE通路中相关指标变化分别于治疗前后应用Real-time PCR技术检测胃黏膜Keap1、Nrf2及ARE mRNA表达变化，具体步骤严格按照试剂盒说明进行，该工作委托广西中医药大学附属瑞康医院完成。

1.4.3胃黏膜ZO-1及Occludin蛋白表达变化分别于治疗前后应用免疫组化技术检测胃黏膜ZO-1及Occludin蛋白表达变化，以PBS为阴性对照替代一抗，以细胞核或膜棕黄色染为阳性，采用image pro-plus6.0进行图像分析。

1.5统计学方法数据应用SPSS 16.0统计软件进行处理，计量资料符合正态分布采用t检验，不符合正态分布采用非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1治疗前后胃黏膜超微结构及上皮细胞形态学变化治疗前，胃溃疡患者电镜下可见胃黏膜上皮细胞微绒毛稀疏甚至脱落消失，细胞间复合连接松解消失，核固缩，出现核周隙，异染色质块状分布于核膜下；线粒体肿胀变大，嵴断裂；粗面内质网扩张，细胞处于坏死期，存在细胞大量自噬现象。治疗后，胃溃疡患者电镜下可见胃黏膜上皮细胞体积明显变小，核染色质边集、核固缩，核膜断核碎裂，细胞器明显扩张肿胀、碎裂，空泡化，凋亡小体形成，亦存在细胞自噬现象。见图1和图2。

图1　治疗前胃黏膜电镜下超微结构表现(×12 000)

2.2治疗前后胃黏膜Keap1、Nrf2及ARE表达变化治疗后，胃溃疡患者胃黏膜Keap1、Nrf2及ARE表达均明显高于治疗前(P均<0.05)。见表2。

图2　治疗后胃黏膜电镜下超微结构表现(×12 000)

时间nKeap1Nrf2ARE治疗前300.98±0.121.04±0.090.87±0.10治疗后301.68±0.11①1.97±0.14①1.85±0.09①

注：①与治疗前比较，P<0.05。

2.3治疗前后胃黏膜ZO-1及Occludin蛋白表达变化治疗前，胃黏膜ZO-1及Occulidin蛋白阳性分布面积分别为(2 026.56±321.78)μm3、(2 432.43±278.76)μm3；治疗后，胃黏膜ZO-1及Occulidin蛋白阳性分布面积分别为(4 571.43±268.97)μm3、(4 328.91±376.51)μm3。治疗前后比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

3讨论

晚近20年“无酸则无溃疡”的理念已经为消化界广为接受，但是胃溃疡的发病率和复发率未见明显下降，仅有胃溃疡并发症的发生率和手术率已明显下降。本课题组前期研究发现，幽门螺杆菌诱导先天免疫反应失调，基于模式识别受体与风险相关因子信号在该反应中占据重要地位，其中ROS直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，是幽门螺杆菌诱导胃黏膜受损的可能机制之一。生理情况下，机体有一套复杂的氧化应激应答系统，当暴露于亲电子试剂或活性氧刺激时，能诱导出一系列的保护性蛋白，以缓解细胞所受的损害[8]。Nrf2是CNC转录因子家族成员，含有6个高度保守的结构域Neh(Nrf2-ECH homology)，分别被命名为Nehl-Neh6[9]。Nehl区包含1个C端亮氨酸拉链结构bZip(basic leucime zipper)，bZip与细胞核内小Maf蛋白(small Maf proteins)形成异二聚体，使Nrf2能够识别、结合ARE，从而启动目标基因转录。Neh1区是Nrf2与胞浆蛋白Keap1结合区，含有ETGE基序、DLG基序两个结合位点。当进入细胞核的Nrf2以Nrf2-Maf的形式与ARE结合后并不能立即启动转录，尚需要其他辅助蛋白如CREB结合蛋白、转录激活剂与Nrf2的Neh4，Neh5两个结构域结合后才能启动转录过程[10]。Keap1是Nrf2在细胞质中的结合蛋白，并与肌动蛋白结合锚定于胞浆中，含有5个结构域，分别为N端结构域(NTR)、干预区(IVR)、BTB区、双甘氨酸重复区(DGR)和C端结构域(CTR)。其中DGR区也叫Kelch区，是Keap1与Nrf2的结合区，同时也是与胞浆内肌动蛋白结合的位点[11-12]。本研究发现，治疗前胃溃疡患者胃黏膜Keap1、Nrf2及ARE表达上升，电镜下可见胃黏膜上皮细胞稀疏，细胞坏死，及细胞自噬；治疗后胃黏膜Keap1、Nrf2及ARE表达下降，电镜下胃黏膜上皮细胞体积明显变小，核染色质边集、核固缩，核膜断核碎裂，细胞凋亡及自噬。舒胃汤可能通过下调Keap1、Nrf2及ARE表达，改善胃黏膜上皮超微结构的效用。

舒胃汤具有促进上皮细胞修复、改善胃黏膜屏障的作用，维持胃黏膜屏障完整对于溃疡治愈是非常重要的一环。胃黏膜上皮细胞间的紧密连接(Tight junction，TJ)是胃黏膜屏障的重要组成部分，它位于相邻细胞间隙的顶端侧面，具有维持细胞极性和调节渗透性2个主要功能，主要由闭锁(Occludin)蛋白、zonula occludens(ZOs)蛋白、Claudin蛋白以及连接黏附分子(JAM)等组成[13]。Occludin及Claudin是跨膜蛋白，其细胞外的部分与相邻细胞间的跨膜连接蛋白互相作用，封闭细胞间隙，其细胞内的部分则与ZOs(ZO-1，2，3)相连；ZOs属于胞浆蛋白，把Occludin蛋白和肌动蛋白骨架连接在一起，形成稳定的连接系统[14-15]。本研究发现，治疗前胃溃疡患者胃黏膜ZO-1、Occuldin蛋白表达下降，治疗后胃黏膜ZO-1、Occuldin蛋白表达上升。舒胃汤具有明确上调ZO-1、Occuldin蛋白表达，修复肠黏膜屏障的作用。

综上所述，舒胃汤具有明确缓解胃溃疡的效用，其疗效可能与上调Keap1、Nrf2及ARE表达，清除氧自由基，上调ZO-1、Occuldin蛋白表达，促进黏膜修复相关。

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Study on Shuwei decoction prevention and treatment of gastric ulcer by regulating Keap1-Nrf2-ARE signal pathway to maintain the integrity of gastric mucosa

ZHANG Qi1, LIANG Haiye1, CHEN Shixin1, ZHANG Tao2

(1. The TCM Hospital of Guiping City,Guiping 537200, Guangxi, China;2. Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of TCM,Nan ning 530011， Guangxi, China)

Abstract:Objective It is to explore the prevention and treatment mechanism of Shuwei decoction on gastric ulcer by observing the changes of Keap1-Nrf2-ARE signal pathway and the ultra structural in gastric mucosa before and after treatment. Methods It was a history control design trial. Thirty patients who conformed to diagnostic criteria, inclusion criteria and exclusion criteria were treated with Shuwei decoction for 6 weeks. The gastric mucosa ultra structure and apoptosis of epithelial cells were observed by electron microscope.The Keap1, Nrf2 ARE gene expression was detected by the fluorescence quantitative PCR. The expression of Occludin and ZO-1 protein was detected by immunohistochemistry. Results Before treatment, gastric ulcer patients under electron microscope visible gastric mucosa epithelial microvillus sparse even shedding vanished, intercellular composite connections were loose or disappeared, nuclear pyknosis, nuclear week gaped, heterochromatin block distribution under nuclear membrane; mitochondrial swelling became larger, cristae fractured; rough endoplasmic reticulum expanded, cells were in the necrotic phase, there were a large number of cells autophagy.After treatment, gastric ulcer patients under electron microscope visible gastric mucosa epithelial cell volume became small, nuclear chromatin margination, nuclear pyknosis, nuclear membrane broken nuclear fragmentation, organelles marked dilation of the swelling, fragmentation, vacuolization, formation of apoptotic bodies, autophagy was also found.After treatment,the levels of Keap1, Nrf2, ARE expressions in gastric mucosa tissue, the positive distribution of ZO-1 and Occulidin protein were significantly higher than that before treatment(P<0.05). Conclusion Shuwei decoction exerts a distinct effect on curing gastric ulcer by regulating Keap1-Nrf2-ARE pathway, reducing oxidative stress injury, up-regulating the expression of ZO-1 and Occludin protein.

Key words:Kelch-like ECH-associated protein1; nuclear factor erythroid 2-related factor 2; antioxidant response；mucosal barrier；gastric ulcer; Shuwei decoction

[收稿日期]2016-01-05

[中图分类号]R573.1

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)13-1395-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.009

[作者简介]张琪，女，副主任中医师，主要从事消化性溃疡中医药防治。[通信作者]张涛，E-mail：398080200@qq.com