不同镇静深度介导PI3K/Akt信号通路对老年患者术后认知功能的影响研究

李小宝，杨志星，吴翼南，周敬民，赵志虎，刘香珠，邹毅清，2

(1. 南京军区福州总医院476医院，福建 福州 350002；2. 福建医科大学福总临床医学院，福建 福州 350025)



论著

不同镇静深度介导PI3K/Akt信号通路对老年患者术后认知功能的影响研究

李小宝1，杨志星1，吴翼南1，周敬民1，赵志虎1，刘香珠1，邹毅清1，2

(1. 南京军区福州总医院476医院，福建 福州 350002；2. 福建医科大学福总临床医学院，福建 福州 350025)

[摘要]目的观察不同镇静深度对老年下肢矫形手术患者术后认知功能及脑脊液中PI3K/Akt信号通路的影响。方法根据不同镇静深度指数(CSI)，将行下肢矫形手术ASAⅠ～Ⅱ级老年患者70例分为CSI-50组35例和CSI-80组35例。在术前1 d及术后3，7 d使用术后恢复质量评估量表(PQRS)新认知评价体系评估患者的认知功能水平。利用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测2组患者蛛网膜下腔穿刺置管成功后(t0)、插入喉罩后即刻(t1)及手术后6 h(t2)、24 h(t3)和48 h(t4)脑脊液中PI3K、Akt、pAkt、bcl、bax的浓度。结果术后2组患者认知功能均出现降低，CSI-50组变化较CSI-80组明显；2组术后7 d MMSE评分恢复正常，而PQRS评分则显示患者仍存在认知功能缺损；PQRS评分显示术后POCD发生率明显高于MMSE评分。Western blotting结果显示，2组t1、t2、t3及t4时间点PI3K、pAkt、bcl水平均明显低于t0时(P均<0.05)，而bax水平明显高于t0时(P均<0.05)，且t1～t4时间点各指标水平CSI-50组均明显低于CSI-80组(P均<0.05)。结论镇静深度对老年下肢矫形手术患者术后认知功能有不同程度影响，其影响机制可能与介导PI3K/Akt信号通路的标志性蛋白表达水平有关。

[关键词]镇静深度；认知功能；术后；PI3K/Akt信号通路

认知是机体对外界事物的感知，是个体有计划、有目的地获取信息、解决问题及执行命令的基础。认知功能障碍对患者所造成的影响远远超过了躯体功能障碍，导致其生活和社会适应性的障碍，无法独立生活和工作，严重影响患者的生活质量和全面康复，并大大增加了家庭和社会的负担[1-2]。部分患者尤其是老年患者在进行手术治疗后出现中枢神经系统并发症，表现为社交能力减弱、记忆力减退、认知能力及技巧退化，这类表现统称为术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)。目前认为POCD的发病机制与多种因素有关[3]，尚无统一的诊断标准。张百军等[4]研究发现不同中脑电双频指数与老年患者术后认知功能的发生有关，过深的麻醉深度可能影响、威胁患者的生命安全，过浅的麻醉深度可能导致患者术中清醒，出现长期精神创伤，因此POCD的发生与麻醉深度之间的关系是目前临床探讨的热点问题。近年研究发现 PI3K/Akt 通路通过调节中枢神经系统的凋亡和自噬管理着细胞的存活，该通路参与了神经系统的学习和记忆等多种生理功能[5-8]。因此提出设想：不同麻醉深度下POCD程度不同是否通过PI3K/Akt信号通路进行桥接？基于此，本研究拟通过观察七氟烷不同麻醉指数(CSI)腰麻下下肢矫形手术老年患者术后认知功能及脑脊液中PI3K/Akt 信号通路中标志性蛋白的变化，以期寻找适宜的镇静深度以减轻老年患者术后POCD的程度，现将结果报道如下。

1临床资料

1.1一般资料选择2012年10月—2014年10月在福州总医院476医院接受下肢矫形手术的老年患者70例，男41例，女29例；年龄67～82(68.2±5.92)岁；ASAⅠ～Ⅱ级。均无认知功能障碍，简易智能量表(MMSE)评分≥23分；无合并明显心、脑、肾等重大脏器疾病，无精神异常史及家族史，无服用镇静催眠药物史，无脊柱畸形。根据CSI将患者分为CSI-50组和CSI-80组，每组35例，2组年龄、性别、体质量、ASA分级比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性，见表1。

表1　2组一般资料比较

1.2方法患者术前禁食12 h、禁水4 h，采用静注咪达唑仑1 mg、1%利多卡因20 mL经腹股沟入路在神经刺激仪引导下行患肢股神经阻滞。效果确切后侧卧于手术床上，患肢在上，选择L4—5间隙，以改良Tuohy穿刺针行硬膜外穿刺成功后，使用连续腰麻导管(22G，Spinocath导管，德国Braun公司)通过Touhy针刺入蛛网膜下腔，拔出针芯后将Spinocath导管向头侧置入4 cm，见脑脊液后注入0.375%布比卡因轻比重液(0.75%布比卡因和注射用水1∶1体积混合)2.7 mL，速率0.05 mL/s，10 min后用冰块测试温度阻滞平面，如未达T10则追加0.5～1 mL。麻醉平面稳定在T10后，静脉注射丙泊酚1～2 mg/kg、芬太尼1 μg/kg，CSI降至50后置入喉罩接麻醉机保留自主呼吸，分别吸入七氟烷，CSI-50组使CSI维持在50±5，CSI-80组使CSI维持在80±5。术中监测心电图、无创血压、脉搏氧饱和度、心率、中心静脉压、直接动脉压、心排血量、外周血管阻力、肺循环阻力及CSI。手术结束时停止吸入七氟烷，静脉注射舒芬太尼0.1 μg/kg和地塞米松5 mg，待CSI恢复至90以上时拔除喉罩。术后患者自控镇痛用药为舒芬太尼150 μg、格拉司琼8 mg、纳洛酮0.4 mg用生理盐水稀释至100 mL，背景输注速度2 mL/h，患者自控镇痛0.5 mL/min，锁定时间15 min。

1.3观察指标

1.3.1恢复质量评估量表(PQRS)评分在术前1 d及术后3 d、7 d使用PQRS新认知评价体系评估患者的认知功能，包括定向力、复述数字(正序/倒序)、回忆语语及组词能力。以术后评分-术前评分的差值为评定标准，定向力≥0分；正序复述数字≥-2分；倒序复述数字≥-1分；回忆词语≥-3分及组词≥-3分。出现上述任何一项即认为出现POCD。

1.3.2MMSE量表评分该量表包括时间空间定向力、记忆力、注意力及计算力、回忆能力、语言能力，总分30分，<23分为认知功能缺陷。

1.3.3脑脊液中PI3K/Akt信号通路标志性蛋白水平将脑脊液标本以3 000 r/min 4 ℃离心10 min，收集上清。根据DAB方法对所提蛋白液进行浓度测定。以100 μL蛋白液中加入25 μL的上样缓冲液于100 ℃金属浴中变性。按照每泳道上样量为50 μg蛋白计算上样量。电泳(4%浓缩胶，12%分离胶，120 V，50 mA，1.5 h)结束后将凝胶取出，用PVDF膜转印，遵循胶在负极膜在正极的原则，50 V，100 mA，2 h。5%脱脂奶粉液封闭2 h，TBS洗3次，每次5 min，分别加入5%脱脂奶粉按1∶1 000稀释的抗PI3K、p-Akt、bcl、bax和β-actin抗体，4 ℃孵育过夜，TBS洗3次，每次5 min，加入碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG(1∶2 000)室温2 h，TBS洗3次，每次5 min。将滤膜放入配好的显色液中显色15～30 min，计算机扫描图像，并由生物图像分析系统(Bio-Rad 公司,Model Gel Doc 2000, 美国)分析处理。

2结果

2.12组认知功能评分比较2组术前1d PQRS评分及MMSE评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。2组术后3 d、7 d PQRS评分均明显低于术前1 d(P均<0.05)，且各时间点PQRS评分CSI-50组均明显低于CSI-80组 (P均<0.05)；2组术后3 d MMSE评分均明显低于术前1 d(P均<0.05)，且CSI-50组明显低于CSI-80组(P<0.05)，2组术后7d MMSE评分与术前1d比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2　2组不同时间点认知功能评分比较±s，分)

注：①与术前1 d比较，P<0.05；②与CSI-50组比较，P<0.05。

2.22组不同评分手段POCD发生率比较PQRS评分显示，CSI-50组术后发生POCD 14例(40%)，CSI-80组术后发生POCD 10例(28%)；MMSE评分显示，CSI-50组术后发生POCD 12例(34%)，CSI-80组术后发生POCD 8例(23%)。PQRS评分显示POCD发生率明显高于MMSE评分(P<0.05)。

2.32组PI3K/Akt信号通路标志性蛋白水平比较2组t1、t2、t3及t4时间点PI3K、pAkt、bcl水平均明显低于t0时(P均<0.05)，而bax水平明显高于t0时(P均<0.05)，且t1～t4时间点各指标水平CSI-50组均明显低于CSI-80组(P<0.05)。见图1及表3。

图1　2组PI3K/Akt信号通路各标志性蛋白水平

时间PI3K/β-actinCSI-80组CSI-50组pAkt/β-actinCSI-80组CSI-50组bcl/β-actinCSI-80组CSI-50组bax/β-actinCSI-80组CSI-50组t01.16±0.211.15±0.181.33±0.201.27±0.191.25±0.111.30±0.140.46±0.120.35±0.16t11.03±0.15①0.93±0.20①②1.26±0.18①1.13±0.21①②1.11±0.23①1.08±0.18①②0.59±0.11①0.51±0.15①②t20.91±0.18①0.83±0.15①②1.20±0.19①1.09±0.17①②0.95±0.15①0.89±0.18①②0.76±0.20①0.68±0.11①②t30.79±0.22①0.61±0.08①②1.15±0.15①0.66±0.09①②0.75±0.12①0.46±0.10①②0.99±0.15①0.83±0.23①②t40.58±0.13①0.38±0.11①②1.08±0.17①0.43±0.11①②0.56±0.15①0.22±0.13①②1.15±0.14①0.92±0.18①②

注：①与t0比较，P<0.05；②与CSI-80组比较，P<0.05。

3讨论

Bedford 于上世纪50年代首次提出老年患者术后出现痴呆的情况，而POCD的概念是近10余年才被逐渐重视。本研究使用传统MMSE评分法进行认知功能评定显示2组患者于术后3 d均伴有MMSE评分显著降低，但至术后7 d 2组基本达到正常水平；而2组术后7 d PQRS评分虽均有提升，但是仍然低于术前1 d，并且PQRS评分显示POCD发生率高于MMSE手段评估所得POCD发生率，说明虽然MMSE评分可体现术后认知功能变化，但其敏感度低于PQRS评分；同时发现不同时间点CSI-80组认知功能评分均高于CSI-50组，说明CSI为80时，术后的认知状态好于CSI为50时。

随着对POCD研究的逐渐深入，认为老年人发生POCD的机制与中枢神经退行性改变关系密切，而细胞凋亡是神经退行性改变的主要方式。PI3K/Akt是经典的抗凋亡信号转导通路，它通过影响下游凋亡相关蛋白、细胞周期调节蛋白等效应分子的活化过程，在细胞的增殖、凋亡、膜泡转运和细胞的恶性转化等众多病理生理过程中起重要作用。PI3K是磷脂激酶家族中的重要成员，具有特异的催化磷脂酰肌醇脂类物质的激酶作用，也是参与细胞内信号转导的信号分子之一，功能上是蛋白激酶B活化的首要调节者。在中枢神经系统病变时被证明该通路在损伤后被激活，并可以通过多种途径发挥抗凋亡作用[9]。PI3K/Akt信号传导调节bcl-2家族成员的活性，PI3K依赖性的Akt的激活可以使促进细胞凋亡蛋白bad磷酸化，而抑制细胞凋亡蛋白bcl-2发挥抗凋亡作用。PI3K/Akt通路的激活还可以使促细胞凋亡蛋白bax磷酸化而失活，从而抑制细胞凋亡。另活化的Akt能够阻止线粒体释放细胞色素C及凋亡诱导因子，从而抑制细胞凋亡[10]。近年研究显示，PI3K/Akt通路作为促存活信号，参与了逆转中枢神经退行性改变的作用[11]。本研究利用Westernblotting技术检测不同时间点脑脊液中PI3K/Akt信号通路上标志蛋白的水平变化，结果显示不同时间点PI3K、pAkt、bcl、bax水平的确发生了变化，其中各时间点CSI-50组各标志性蛋白水平变化的趋势较CSI-80组明显。提示不论何种深度麻醉均可造成PI3K/Akt信号通路的改变，因此认为POCD的发生与细胞凋亡关系密切，且可能通过PI3K/Akt信号通路进行桥接，而CSI为80时对中枢神经的保护效应高于CSI为50时。

综上所述，镇静深度对老年下肢矫形手术患者术后认知功能有不同程度影响，此机制可能与介导PI3K/Akt信号通路的标志性蛋白表达水平有关。

[参考文献]

[1]陈贵珍，鲁开智，王恩琴，等. 七氟醚与异丙酚对老年人腹部手术术后认知功能的影响[J]. 重庆医学，2010，39(17)：2287-2289

[2]王延国. 七氟烷和丙泊酚麻醉对老年肺癌患者术后认知功能的影响[D]. 天津：天津医科大学，2012

[3]黄月，任秀花，张杰文，等. A1-42单克隆抗体对阿尔茨海默病大鼠认知能力及脑组织A?和ChAT表达的影响[J]. 郑州大学学报：医学版，2011，46(1)：88-91

[4]张百军，杨赵栋，郑旻,等. 硬膜外麻醉和全身麻醉对老年骨科患者术后认知功能影响对比[J]. 浙江医学,2015,37(7): 595-596

[5]Miyawaki T,Mashiko T,Ofengeim D,et al. Ischemic preconditioning blocks BAD translocation,Bcl-xL cleavage,and large channel activity in mitochondria of postischemic hippocampal neurons[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008,105(12):4892-4897

[6]Bruel-Jungerman E,Vevrac A,Dufour F,et al. Inhibition of PI3K-Aktsignaling blocks exercise-mediated enhancement of adult neurogenesis and synaptic plasticity in the dentate gyrus[J]. PLoS One，2009,4(11):e7901

[7]Li L,Qu Y,Mao M,et al. The involvement of phosphoinositid 3-kinase/Akt pathway in the activation of hypoxia-inducible faetor-lalpha in the developing rat brain after hypoxia-isehemia[J]. Brain Res，2008,1197:152-158

[8]Su KH,Shyue SK,Kou YR,et al. activation of endothelial nitric oxide synthase[J]. J Cell Physiol，2011,226(12):3330-3339

[9]Koh PO. Melatonin attenuates the focal cerebral ischemic injury by inhibiting the dissociation of pBad from 14-3-3[J]. J Pineal Res，2008,44(1):101-106

[10] Koh PO,Cho GJ,Choi WS. 17beta-estradiol pretreatment prevents the global ischemic injury-induced decrease of Akt activation and bad phosphorylation in gerbils[J]. J Vet Med Sci，2006,68(10):1019-1022

[11] Zhou Y,Lekic T,Fathali N,et al. Isoflurane posttreatment reduces neonatal hypoxic-ischemic brain injury in rats by the sphingosine-1-phosphate/phosphatidylinositol-3-kinase/Akt pathway[J]. Stroke，2010,41(7):1521-1527

Study of effects of different depth of sedation mediated PI3K/AKT signaling pathway on cognitive function in elderly patients after surgery

LI Xiaobao1, YANG Zhixing1, WU Yinan1, ZHOU Jingmin1, ZHAO Zhihu1, LIU Xiangzhu1, ZOU Yiqing1,2

(1. 476 Hospital of Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou 350002, Fujiang, China; 2. The Clinical Medical College of Fujian General Hospital of Fujian Medical College, Fuzhou 350025, Fuzhou, China)

Abstract:Objective It is to observe the effects of different depth of sedation on postoperative cognitive function in elderly patients with lower limbs orthopedic operation, and to discuss the influence on PI3K/AKT signal pathway in the cerebrospinal fluid. Methods 70 cases of elderly patients with lower limbs orthopedics ASA Ⅰ～Ⅱ grade were divided into CSI-50 group (35 cases) and the CSI-80 group (35 cases) according to the different depth of sedation. On 1 d before, 3 d and 7 d after operation, the new cognitive evaluation system in postoperative recovery Physician Quality Reporting System (PQRS) was used to assess the cognitive function levels of the patients. The concentrations of PI3K, AKT, pAKT, Bcl and Bax in cerebrospinal fluid were determined by Western blotting after the success of the subarachnoid puncture catheter (t0), insert a laryngeal mask immediately (t1), 6 h(t2), 24 h(t3), 48 h (t4)after operation. Results The scores of postoperative cognitive function of the patients of the two groups both reduced, and the changes of CSI-50 group were more obviously than that of CSI-80 group. The MMSE scores became normal in both groups in 7 d after operation, while the PQRS scores showed that the patients still had postoperative cognitive function dysfunction(POCD), the incidence of POCD evaluated by PQRS scores was higher than that evaluated by MMSE scores. Western blotting results showed that the levels of PI3K, pAKT, Bcl at t1, t2, t3, and t4 were higher while that of bax was lower than those at t0 (P<0.05), and every index at t1-t4 was lower in CSI-50 group than that in CSI-80 group (P<0.05). Conclusion Different depth of sedation had more or less effects on the postoperative cognitive function in elderly patients with lower limbs orthopedic operation, the impact mechanism may be related to the mediation on iconic protein expression levels of PI3K/AKT signal pathway.

Key words:different depth of sedation; cognitive function; postoperation; PI3K/AKT signaling pathway

[收稿日期]2016-01-30

[中图分类号]R614.2

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)13-1369-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.001

[基金项目]福建省科技厅重点项目(2012Y0059)；南京军区重点课题(13ZD38)

[作者简介]李小宝，男，主治医师，研究方向为危重患者围手术期处理。[通信作者]邹毅清，E-mail：yiqing51@163.com