小柴胡汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清中IL-17、IL-23及IL-27的影响

张　莹，周小莉，戴　敏，吴　斌

(重庆市中医院，重庆 400021)



小柴胡汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清中IL-17、IL-23及IL-27的影响

张莹，周小莉，戴敏，吴斌

(重庆市中医院，重庆 400021)

[摘要]目的观察小柴胡汤对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27的影响，并探讨其可能的作用机制。方法将40只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、雷公藤多苷组、小柴胡汤低剂量组和小柴汤高剂量组，每组8只。除正常组外，其余组大鼠采用注射Ⅱ型胶原乳化剂的方法建立CIA模型。于首次注射Ⅱ型胶原乳化剂2周后开始，雷公藤多苷组给予雷公藤多苷20 mg/(kg·d)灌胃，小柴胡汤低、高剂量组分别给予小柴胡汤9 g/(kg·d)和18 g/(kg·d)灌胃，正常组给予等量生理盐水灌胃，均连续4周。测量建模1周、2周后和灌胃1周、2周、4周后大鼠关节左右径和前后径，计算灌胃前和灌胃1周、2周、4周后关节炎指数，灌胃4周后采用ELISA法测定各组大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平。结果各给药组灌胃后踝关节肿胀程度均明显轻于模型组(P均<0.05)，关节炎指数及血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明显低于模型组(P均<0.05)，其中小柴胡汤高剂量组血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明显低于小柴胡汤低剂量组(P均<0.05)。结论小柴胡汤可降低CIA大鼠血清IL- 17、IL- 23、IL-27水平，可能是其治疗类风湿关节炎的作用机制之一。

[关键词]小柴胡汤；胶原诱导性关节炎；IL-17；IL-23；IL-27

类风湿关节炎(RA)是一种病因不明的系统性自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全阐明，细胞因子的异常表达及相互作用在RA关节软骨和骨质破坏方面起重要作用[1]。随着人们对RA认识的不断深入，发现Th17/Treg细胞比率失衡在RA发病过程中发挥着重要作用[2-3]，而IL-6、IL-23、IL-17和IL-27等相关细胞因子的异常表达与其比率失衡有密切关系[4-5]。RA属于中医痹证范畴，中医少阳治痹古今有之，小柴胡汤是张仲景治疗伤寒病见少阳证的代表方剂。笔者前期研究发现，小柴胡汤对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠有显著的抗炎作用[6]，而对于新的临床应用，则需要更多的药理研究作为基础。故本研究通过观察小柴胡汤对CIA大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平的影响，探讨其作用机制，旨在为其临床应用提供更多的依据。

1实验资料

1.1材料

1.1.1动物SPF级雄性Wistar大鼠，体质量(200±20)g，购于第三军医大学实验动物中心(动物合格证号：20120011)，笼中鼠颗粒饲料饲养，自由饮食，适应性饲养1周后进行实验操作。

1.1.2试剂牛Ⅱ型胶原(奥多福尼生物科技，中国)，不完全弗氏佐剂(Sigma，美国)，IL-17、IL-23、IL-27 ELISA检测试剂盒(Roche，瑞士)，水合氯醛(Life technologies，美国)，冰醋酸(生工生物，中国)。

1.1.3药物雷公藤多苷片,远大医药黄石飞云制药有限公司提供，用时用蒸馏水溶解稀释；小柴胡汤组方：柴胡24 g、黄芩9 g、半夏9 g、生姜9 g、党参9 g、甘草9 g、大枣12 g，各味药均由重庆市中医院药剂科提供饮片并煎制，浓缩液含生药2 g/mL。

1.2方法将Wistar大鼠40只随机分为正常组、模型组、雷公藤多苷组、小柴胡汤低剂量组和小柴胡汤高剂量组，每组8只。除正常组外，其余4组大鼠均建立CIA模型：用0.1 mmol/L醋酸10 mL溶解Ⅱ型胶原蛋白40 mg(4 ℃过夜)，再与10 mL的不完全弗氏佐剂均匀混合，于冰浴中充分乳化。在无菌条件下在大鼠尾根及背部多点皮内注射，初次免疫共注射乳剂0.2 mL，1周后予以加强免疫，同法再注射乳剂0.2 mL。初次免疫2周按关节炎指数(AI)对大鼠进行评分，AI>4分证明造模成功。之后小柴胡汤低剂量组给予小柴胡汤9 g/(kg·d)(通过成人用药剂量与实验动物用药量换算公式换算而得)灌胃，小柴胡汤高剂量组给予小柴胡汤18 g/(kg·d)灌胃，雷公藤多甙组给予雷公藤多甙液20 mg/(kg·d)灌胃，正常组给予等量生理盐水灌胃，均每天1次，连续4周。

1.3观察项目

1.3.1关节肿胀程度游标卡尺测量各组大鼠双后肢踝关节下缘左右径和前后径，每周1次。

1.3.2AI每周采用关节评分法对每只大鼠足爪关节进行评分，计算AI[3]。评分方法：0分为无红肿；1分为趾关节稍肿，足爪或足垫单个区域炎症；2分为关节轻度红肿，足爪和足垫或踝关节2个区域以上的炎症；3分为关节中度红肿，轻度功能障碍；4分为关节重度红肿，僵直甚至畸形，严重功能障碍。得分最高16分。

1.3.3血清IL-17、IL-23、IL-27水平灌胃4周后，从各组大鼠的球后静脉丛取血，凝固后离心取血清，于-80 ℃冰箱保存。ELISA法测定血清IL-17、IL-23、IL-27水平。

2结果

2.1各组大鼠一般状态正常组大鼠随着饲养时间的延长，体质量增加，精神状态好，鼠毛有光泽，行动自如，无异常状态出现；模型组大鼠食欲减退，体质量逐渐下降，精神萎靡，鼠毛失去光泽，行动迟缓；给药后大鼠食欲逐渐恢复，体质量有所增加，行动较前自如，精神状态有所恢复。

2.2各组大鼠关节肿胀程度模型组建模2周后大鼠双后肢左右径、前后径均明显长于正常组(P均<0.05)。灌胃2周、4周后，各给药组大鼠双后肢左右径及前后径均明显短于模型组 (P均<0.05)。小柴胡汤高、低剂量组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1及表2。

2.3各组大鼠AI比较灌胃2周、4周后各给药组大鼠AI均明显低于模型组(P均<0.05)；灌胃4周后小柴胡汤高剂量组AI明显低于小柴胡汤低剂量组(P<0.05)，小柴胡汤高剂量组与雷公藤多苷组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4各组大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平比较灌胃4周后，模型组大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明显高于正常组(P均<0.05)，各给药组血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明显低于模型组(P均<0.05)；小柴胡汤高剂量组血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明显低于小柴胡汤低剂量组(P均<0.05), 而小柴胡汤高剂量组与雷公藤多甙组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

3讨论

表1　各组大鼠不同时间关节左右径比较±s，mm)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

表2　各组大鼠不同时间关节前后径比较±s，mm)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

表3　各组大鼠不同时间AI比较±s，分)

注：①与模型组比较，P<0.05；②与小柴胡汤低剂量组比较，P<0.05。

表4　各组大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与小柴胡汤低剂量组比较，P<0.05。

RA以关节慢性炎症及关节破坏为主，最终导致关节畸形而致残。最新研究发现Treg细胞的抑炎作用及Th17细胞的促炎作用与RA发病密切相关，RA患者外周血Th17细胞比率明显增加，Treg细胞比率降低，最终导致Th17/Treg细胞比率失衡，其可能与RA的发生发展及活动性有关[7-8]。

IL-17是Th17细胞分泌的主要细胞因子，其能介导炎症反应，在RA的发病过程及治疗中发挥着重要作用[9]。IL-17发挥致炎作用的途径主要是通过诱导IL-6、TNF-α等炎症细胞因子以及趋化因子的表达，使炎症细胞侵入关节局部组织而造成损[10]。研究发现，IL-17在RA患者血清及关节液中表达很高，其在RA发病中的作用主要表现在多种炎性细胞因子从滑膜细胞释放，软骨细胞基质的合成受到抑制，导致破骨细胞的活性增强，最终引起骨侵蚀[11]。最新研究报道，对于RA的治疗，阻断TNF-α及IL-17对于抑制细胞因子、趋化因子及基质酶的表达有非常重要的作用[12]。

IL-23是2000年发现并命名的IL-12家族成员，为异二聚体结构。IL-23能够刺激CD4+细胞分化为Th17细胞，产生IL-17，并刺激基质细胞生成IL-6、IL-1、TNF-α等细胞因子，是RA发病过程中重要的促炎因子之一，在RA发病和骨破坏中起到了关键作用[13]。IL-23对Th17细胞的维持和扩增具有重要意义[14]。IL-23/IL-17轴在炎症发生中起重要作用，其免疫通路失调使自身组织和抗原的免疫耐受遭到破坏，从而导致RA等自身免疫疾病的发生[15]。

IL-27是一种新的细胞因子，隶属IL-12家族，在不同的自身免疫性疾病上可表现出抗炎和促炎双重作用[16]。IL-27能促进分泌IL-10的Treg细胞分化，抑制Th17细胞的产生[17]；但也有学者指出，在缺乏感染编码信号转导和转录激活因子1(STAT1)时，IL-27能加速Th17的分化[18]。国内临床研究发现， IL-27参与RA的疾病过程，并将是一个较好的反映RA活动的早期指标[19]。Moon等[20]研究发现，IL-27通过调节Th17及Treg细胞平衡，在改善CIA关节炎症状方面有潜在性的作用。

小柴胡汤由柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、生姜、大枣组成，具有疏利枢机、宣达上下、扶正祛邪的作用。本研究发现，各给药组踝关节肿胀程度均明显轻于模型组，AI及血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明显低于模型组，其中小柴胡汤高剂量组血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明显低于小柴胡汤低剂量组。提示小柴胡汤能显著减轻大鼠踝关节肿胀程度，降低AI及血清IL-17、IL-23、IL-27水平。小柴胡汤可降低CIA大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平，可能是其治疗类风湿关节炎的作用机制之一。

综上所述，小柴胡汤可降低CIA大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平，可能是其治疗RA的作用机制之一，其治疗RA更多的作用机制还有待进一步研究。

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Effect of Xiaochaihutang on IL-17,IL-23,IL-27 in serum of rats with collagen-induced arthritis

ZHANG Ying, ZHOU Xiaoli, DAI Min, WU Bin

(Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, Chongqing 400021, China)

Abstract:Objective It is to observe the effect of Xiaochaihutang on IL-17, IL-23, IL-27 in serum of rats with collagen-induced arthritis(CIA)and to explore the possible mechanisms. Methods 40 Wistar rats were divided into nomal group, model group, tripterygium glycosides group, high and low doses of Xiaochaihutang groups. Rheumatoid arthritis model was established in rats in every group except normal group by type Ⅱ collage induction. In 2 weeks after first injection of type Ⅱ collage, tripterygium glycosides group was given tripterygium glycosides 20 mg/(kg·d) by lavage, low and high doses of Xiaochaihutang groups were given 9 g/(kg·d) and 18 g/(kg·d) Xiaochaihutang respectively by lavage, normal group was given the same volume of normal saline. All the groups were treated for 4 weeks. The left-right diameter and anterior-posterior diameter of joint of the rats were measured at one week, two weeks after model establishment, and at one, two, four weeks after lavage. The arthritis index was calculated before lavage, at one, two, four weeks after lavage. Four weeks after the treatment, the expressions of IL-17, IL-23 and IL-27 in serum were detected by ELISA. Results Compared with model group, the swelling of ankle joints and arthritis index of high and low doses of Xiaochaihutang groups reduced significantly (P<0.05). Xiaochaihutang groups and tripterygium glycosides group down-regulated the expressions of IL-23， IL-17 and IL-27 (P<0.05). Xiaochaihutang group was better than that of tripterygium glycosides control group (P<0.05). Conclusion Xiaochaihutang can reduce expressions IL-17, IL-23 and IL-27 in serum of CIA rats, it may be one of its mechanisms in the treatment of rheumatoid arthritis.

Key words：Xiaochaihutang; collagen-induced arthritis; IL-17; IL-23; IL-27

[收稿日期]2015-12-01

[中图分类号]R-332

[文献标识码]B

[文章编号]1008-8849(2016)13-1391-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.008

[作者简介]张莹，女，硕士研究生，主治医师，主要从事风湿病基础与临床研究工作。[通信作者]周小莉，E-mail:709885987@qq.com