补肾活血法复方解除雷公藤甲素抑制人卵巢颗粒细胞分泌功能的研究

龙　旭,吴克明,廖风娇,陆柳如

(成都中医药大学，四川 成都 610072)



补肾活血法复方解除雷公藤甲素抑制人卵巢颗粒细胞分泌功能的研究

龙旭,吴克明,廖风娇,陆柳如

(成都中医药大学，四川 成都 610072)

[摘要]目的探讨雷公藤甲素对体外培养人卵巢颗粒细胞增殖的影响及补肾活血中药复方对此影响的解除作用。方法MTT法检测雷公藤甲素6种不同浓度对人卵巢颗粒细胞原代培养细胞增殖的影响，并计算出细胞半数抑制浓度值(IC50)；放免法分别检测颗粒细胞正常组(正常组)、雷公藤甲素抑制组(TL组)、中药含药血清组(TL+中药组)的雌二醇(E2)、孕酮(P)水平。结果雷公藤甲素浓度≥1 μg/mL时对人卵巢颗粒细胞的增殖有明显抑制作用，且呈剂量依耐性；当IC50为5.33 μg/mL时，TL组的E2、P水平明显低于正常组(P均<0.05)，而TL+中药组E2、P水平均明显高于TL组(P均<0.05)。结论雷公藤甲素能抑制体外培养的人卵巢颗粒细胞的分泌功能，补肾活血中药复方能解除其抑制作用，提高体外培养的人卵巢颗粒细胞的分泌功能。

[关键词]补肾活血法；人卵巢颗粒细胞；雷公藤甲素；雌二醇；孕酮

卵泡发育障碍包括卵泡发育、成熟和排出障碍，主要表现为月经量少、月经稀发、闭经、不孕等，常见于无排卵性功血、多囊卵巢综合征、卵巢储备功能下降甚至卵巢早衰等疾病，临床上发病率居高不下，严重影响了妇女的生殖和心理健康。祖国医学并无“卵泡发育障碍”这一名称，随着近代医学对上述病症的认识，众多医家遵循“肾主生殖”“经水出诸肾”“经本于肾”的中医理论，临床采用补肾填精法治疗，获得了满意的疗效。卵巢颗粒细胞是卵泡内的主要体细胞成分，它介导促性腺激素影响卵母细胞的发育，并通过自分泌和旁分泌维持卵母细胞成熟的微环境。本实验采用雷公藤甲素以影响体外培养颗粒细胞的增殖，计算出其半数抑制浓度(IC50)，再采用补肾活血中药复方新加归肾丸含药血清进行干预，以观察其对受抑制颗粒细胞分泌功能的影响。

1实验资料

1.1实验药物与试剂新加归肾丸由菟丝子15 g、肉苁蓉15 g、干地黄10 g、山茱萸10 g、淫羊藿10 g、覆盆子10 g、当归10 g、茺蔚子10 g组成，生药总剂量为80 g，由四川新绿色药业科技发展股份有限公司按《中国药典》2005年第1版炮制加工成免煎颗粒剂，每80 g生药相当于免煎颗粒18.4 g。雷公藤甲素(Triptolide，TL，购自上海学汇医学科技有限公司)为无色针柱状结晶，分析标准品，纯度≥99%；DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、PBS缓冲液购自美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)、Percoll液、甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Biosharp公司；雌二醇(E2)、孕酮(P)放射免疫试剂盒购自美国Market INC公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。所用仪器主要有Tecan infinite M200 pro酶标仪、CO2培养箱。

1.2实验动物雌性健康成年SD大鼠，清洁级，6周龄，体质量160～170 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，动物生产合格证号：SCXK(川) 2008-24号。在成都中医药大学附属医院药理实验动物中心分笼喂养，自由饮水摄食，室温控制在22～25 ℃，湿度为70%。

1.3药物的配制

1.3.1TL的配制TL晶体用DMSO溶解后加入无血清DMEM培养液配成不同浓度备用。

1.3.2MTT的配制取50 mg MTT粉，溶于10 mL PBS液(0.2 mmol/L，pH值7.2)中，完全溶解后，0.22 μm针头滤器除菌，分装4 ℃避光保存。MTT终浓度为5 mg/mL。

1.3.3新加归肾丸大鼠含药血清的制备选取新加归肾丸高剂量灌胃大鼠制备含药血清。参照《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表》[1]、《实验动物学》[2]，新加归肾丸按成人体质量的临床用药剂量以人鼠比例换算后20倍(即200 g大鼠每日用药量相当于70 kg成人每日用药量的20倍)，折合大鼠的用药剂量为5.32 g/(kg·d)，将免煎颗粒配成0.532 g/mL溶液，每次以1 mL/100 g灌胃，每日灌胃2次，连续4d。于末次灌胃后1h大鼠股动脉采血，室温静置2h，3 000 r/min离心，取上清液，56 ℃水浴30 min灭活补体，0.22 μm无菌滤器过滤除菌、分装，-20 ℃保存备用。

1.4卵巢颗粒细胞的采集收集2014年2—5月在四川省人民医院生殖中心行常规体外受精(IVF)或卵胞浆单精子显微注射(ICSI)治疗的不孕症患者36例，年龄22～38(27.46±4.65)岁，患者均知情同意。36例患者均采用标准长方案降调节治疗方案促排卵，用药期间监测卵泡发育情况及血清E2和LH水平，根据卵泡情况及时调整药量，促排卵后，当患者两侧卵巢至少有3个卵泡直径≥18mm时，肌肉注射HCG10 000 IU，34～36 h后在阴道B超监测下取卵，收集卵泡液。

1.5人卵巢黄素化颗粒细胞的分离及培养含有颗粒细胞的卵泡液经1 000 r/min离心10 min，弃上清。 取细胞沉淀物置入50% Percoll液中，再1 000 r/min离心20 min，回收界面处的颗粒细胞层，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化5～10 min后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中止消化，1 000 r/min离心10 min，弃上清，经台盼蓝染色细胞存活率85%～90%，将颗粒细胞浓度调整为2×105/孔的单细胞悬液备用。整个细胞收集过程要尽快完成，避免引起颗粒细胞额外的损伤。

1.6不同浓度的TL对人卵巢颗粒细胞生长的影响将1.5收集的人卵巢颗粒细胞调整至1×105/孔接种于96孔培养板内，每孔容积为100 μL，每组取4个复孔，分为正常组及6种不同浓度TL组。待细胞贴壁24 h后，吸去孔内培养上清液，加入不同浓度的TL(1×10-3，1×10-2，1×10-1，1，1×101，1×102μg/mL)200 μL，以无血清DMEM培养基作为空白对照组，36.5 ℃,5% CO2饱和湿度下继续培养48 h。

1.7MTT法检测人卵巢颗粒细胞的增殖功能6种不同浓度的TL处置48 h后，选择490 nm(校正630 nm)波长在酶联免疫检测仪上测各孔的吸光度(OD)值，分别记录TL作用于人卵巢颗粒细胞的浓度效应数据，用IC50软件进行相应处理，得出TL对卵巢颗粒细胞的IC50值。细胞抑制率=(对照组-实验组)/对照组×100%。

1.8新加归肾丸与TL联用对人卵巢颗粒细胞分泌E2、P的影响将1.5收集的人卵巢颗粒细胞调整至1×105/孔接种于96孔培养板内，每孔体积为100 μL，每组取4个复孔，待细胞贴壁24 h后吸取孔内培养上清液，分为正常组、TL组、TL+中药组。正常组加入无血清培养液200 μL；TL组加入IC50浓度的TL 200 μL；TL+中药组加入IC50浓度的TL和新加归肾丸含药血清共200 μL，36.5 ℃,5% CO2饱和湿度下继续培养48 h，收集上清液，应用放射免疫法检测E2、P水平。

2结果

2.1TL对人卵巢颗粒细胞增殖的影响原代培养的人卵巢颗粒细胞经TL处理后，细胞增殖受到明显抑制，抑制率为12.34%～81.33%，呈剂量依赖性，最小有毒剂量为1 μg/mL，见表1。细胞IC50为5.33 μg/mL。

表1　不同浓度的TL对卵巢颗粒细胞

2.2各组卵巢颗粒细胞分泌E2、P水平比较TL组颗粒细胞分泌E2、P水平均明显低于正常组(P均<0.05)，TL+中药组颗粒细胞分泌E2、P水平均明显高于TL组(P均<0.05)。见表2。

表2　各组卵巢颗粒细胞分泌E2、P水平比较±s)

注：①与正常组比较,P<0.05；②与TL组比较,P<0.05。

3讨论

在卵泡发育过程中，颗粒细胞起着支持、营养卵母细胞的功能，并且介导着促性腺激素对卵母细胞成熟的调节，通过自分泌和旁分泌作用，维持有利于卵母细胞成熟的微环境。有研究表明，颗粒细胞的凋亡远早于卵泡闭锁的形态学的变化，亦就是颗粒细胞凋亡达到一定程度后才表现出卵泡闭锁现象[3]。所以，只有颗粒细胞获得抗凋亡的能力，卵泡才能维持其活力，直到排卵[4]。卵泡发育障碍的主要特征是卵泡发育、成熟及排出均出现异常，导致月经失调、不孕症、多囊卵巢综合征、卵泡黄素化不破裂综合征等临床病症。西医对此的治疗主要从调节下丘脑-垂体-卵巢轴，通过促排卵方法诱发卵泡发育，调节体内E2、P的水平，促进卵泡生长及排卵。祖国医学则从肾论治，本因在于肾气亏虚。夏桂成[5]认为肾阴不足，癸水不充，精卵失养，不能发育成熟。吴克明认为卵泡发育障碍的病机在于肾亏精少，肾气不足，天癸不能按期泌至，冲任二脉不得相资；肾精化血不足，血虚冲任血海匮乏；肾气虚弱，鼓动无力；肾气虚弱或肾中阴阳失衡，瘀血阻滞冲任胞宫，冲任气血不畅，导致卵子失于濡养，不能正常发育、排出及受孕[6]。刘涓[7]认为卵子作为生殖之精，它的成熟有赖于肾精的滋养、肾气的推动和促进作用。若肾亏精少，肾气不足，则冲任胞脉失于濡养，冲任气血不畅，气血易停滞而瘀阻，瘀阻胞脉而影响二精相合，致不孕。故补肾益精、养血活血是促卵泡发育和治疗卵巢功能低下的根本大法[8]。多项临床和动物实验研究表明，补肾中药可通过促进卵泡发育，延缓卵巢颗粒细胞衰老，改善卵巢功能，进而改善各种临床症状[9-10]。

新加归肾丸是由新加肉苁蓉菟丝丸化裁而来，临床上用于月经稀发、月经过少、卵巢早衰、卵泡发育不良、多囊卵巢综合征等妇科病症，疗效显著。方中肉苁蓉、菟丝子、淫羊藿益肾精，温肾阳；枸杞子、山茱萸滋补肾阴，肝肾同补；干地黄滋阴养血，去熟地之滋腻，其性微寒，又能牵制淫羊藿之温燥；当归既能助干地黄养血，又能活血调经，使补而不滞，静中有动，动中有补。全方共奏益肾填精、养血活血之功效，具有阴阳双补、动静结合、温而不燥、滋而不腻、通补共济之特点。现代药理学研究表明，菟丝子的主要有效成分菟丝子黄酮能够促进下丘脑-垂体-性腺轴功能，提高垂体对促性腺激素释放激素的反应性，促进卵泡发育，提高应激大鼠雌二醇、黄体酮的水平，同时也能提高垂体促黄体生成素的水平；菟丝子作为一种免疫增强剂，能够参与体内多种免疫调节，增强机体的免疫功能[11-12]。有研究表明，卵巢动脉供血不足可能造成卵泡发育障碍；而当归既能活血化瘀又能养血，可降低血液黏稠度，提高卵巢血供，改善卵巢微环境，进而促使卵泡发育和排出[13]。范培等[14]研究发现补肾活血法联合热敏灸可降低子宫动脉血流阻力指数，促进卵泡发育成熟及子宫内膜生长，提高临床受孕率。

曹俊岩[15]观察发现新加归肾丸可增加雷公藤多苷致卵泡发育障碍大鼠模型体质量，升高模型大鼠卵巢指数、子宫指数及血清E2与P水平，降低IGF-1水平，使模型大鼠卵巢组织ERβ、VEGF及Flk-1表达增加；增加各级卵泡数、成熟卵泡数/卵泡总数及黄体数，减弱FSHR表达；且可使卵巢血管壁变薄，管腔增宽。蔡竞等[16]研究发现新加归肾丸能增加雷公藤多苷致大鼠卵泡发育障碍模型颗粒细胞厚度，中、高剂量能提高cyclinD2mRNA及颗粒细胞cyclinD2蛋白表达量。

本实验选用人卵巢颗粒细胞原代培养为实验基础，利用TL的生殖毒性，研究发现TL对体外培养的颗粒细胞同样有抑制生长的作用，当TL浓度在1 μg/mL时对人卵巢颗粒细胞的增殖有明显抑制作用，且呈剂量依赖性，其IC50为5.33 μg/mL。选用IC50浓度的TL作用于颗粒细胞，结果发现E2、P水平均明显降低，证明TL对体外培养颗粒细胞有抑制作用；而加入新加归肾丸大鼠含药血清后， E2、P水平均明显增高，说明新加归肾丸可解除TL对颗粒细胞的抑制，增加E2、P的分泌量。本研究为补肾活血法临床用于治疗卵泡发育障碍性疾病提供了细胞体外培养的实验依据，并为进一步探讨其分子生物学作用机制奠定了基础。

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The stimulation of kidney-supplement and blood-activation formula on the endocrine function of human ovary granule cell inhibited by Triptolide: An experimental study

LONG Xu, WU Keming, LIAO Fengjiao, LU Liuru

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan, China)

Abstract:Objective It is to study the inhibition of triptolide on the vitro human ovary granule cell and the stimulation of the kidney-supplement and blood-activation formula on the endocrine function of the inhibited human ovary granule cell. Methods The human ovary granule cells were primary-cultured with 6 different densities of triptolide and were tested with MTT. The IC50of triptolide were calculated accordingly. The radioimmunoassay were used to test the normal granule cell (normal group), IC50triptolide granule cell (TL group) and the Xinjiaguishenwan serum granule cell (TL+XJGSW group) for the E2 and P. Results The triptolide with the density of over 1 μg/mL had shown obvious inhibition to the human ovary granule cell proliferation with dosage dependent. When the IC50of granule cell inhibition was 5.33 μg/mL, the levels of E2 and P of TL group were significantly lower compared to the normal group (P all<0.05), while the levels of E2 and P of the TL + XJGSW group were significantly higher than that of TL group. Conclusion Triptolide can inhibit the endocrine function of the vitro human ovary granule cell, kidney-supplement and blood-activation formula could relieve the inhibition and improve endocrine function of the vitro human ovary granule cell.

Key words:kidney-supplement and blood-activation; human ovary granule cell; triptolide; estradiol; progesterone

[收稿日期]2015-03-15

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)02-0126-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.004

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(81173289)

[作者简介]龙旭，女，副主任医师，博士，从事中医药调节生殖内分泌的研究工作。[通信作者]吴克明，E-mail：18981885621@163.com