白藜芦醇对体外卵巢癌SKOV3细胞增殖及荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生长的抑制作用

李　研

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)



白藜芦醇对体外卵巢癌SKOV3细胞增殖及荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生长的抑制作用

李研

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

[摘要]目的研究白藜芦醇(Resveratrol，Res)对体外人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖及荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生长的抑制作用及其机制。方法将对数生长期的人上皮性卵巢癌SKOV3细胞随机分为空白组，白藜芦醇40，20，10 μg/mL干预组和顺铂40 μg/mL干预组。干预48 h后，通过光学显微镜观察各组细胞形态，四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞增殖抑制率；通过流式细胞术检测细胞凋亡情况并计算凋亡率。采用右侧背部皮下注射接种人上皮性卵巢癌SKOV3细胞的方法制备荷人上皮性卵巢癌裸小鼠模型，将50只造模成功小鼠随机分为模型组，白藜芦醇200，100，50 mg/kg组和顺铂组，模型组灌胃生理盐水，各给药组灌胃相应药物，隔天1次。灌胃5次后处死动物取肿瘤组织，称瘤质量并计算抑瘤率；通过HE染色观察肿瘤组织病理形态学变化；通过免疫组织化学法观察肿瘤组织中bcl-2、bax、caspase-3蛋白表达情况并进行半定量分析，计算bax/bcl-2比值。结果在体外，白藜芦醇呈剂量依赖性抑制人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖，且白藜芦醇40 μg/mL干预组细胞增殖抑制率和凋亡率均最高。在体内，白藜芦醇200，100 mg/kg组和顺铂组瘤质量显著低于模型组(P均<0.05)，且白藜芦醇各组抑瘤率呈剂量依赖性升高(P均<0.05)；顺铂组和白藜芦醇200，100 mg/kg组肿瘤组织中bcl-2表达量明显低于模型组(P均<0.05)，caspase-3表达量明显高于模型组(P均<0.05)；各给药组bax表达量和bax/bcl-2比值均明显高于模型组(P均<0.05)。结论白藜芦醇对体外人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖和荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生长均具有抑制作用，其作用机制可能与白藜芦醇能够有效下调bcl-2蛋白表达、上调bax和caspase-3蛋白表达、提高bax/bcl-2比值有关。

[关键词]白藜芦醇；卵巢癌；SKOV3；移植瘤

卵巢癌致死率高居妇科恶性肿瘤首位，严重威胁着女性的生命健康。通过彻底细胞减灭术和术后联合紫杉醇、铂类等一线化疗药物进行综合治疗，3年内复发率仍高于50%，5年生存率仍不到30%[1]。因此，迫切需要研发新型的抗癌药物以及新的治疗方案。白藜芦醇是一种天然存在的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、降糖调脂等多种药理学作用[2-4]。通过动物实验研究发现，白藜芦醇能够有效抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡[5]；白藜芦醇对肝癌也具有一定的治疗作用[6]。本实验通过白藜芦醇干预人上皮性卵巢癌SKOV3细胞，并制备荷人上皮性卵巢癌SKOV3细胞裸小鼠模型，以顺铂为阳性对照，研究白藜芦醇对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖及荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生长的抑制作用，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1细胞和动物人上皮性卵巢癌SKOV3细胞由河北医科大学病理学教研室惠赠；雌性Balb/C裸小鼠(4～6周龄，体质量18～22 g)购于上海斯莱克实验动物有限责任公司(SLAC)，许可证号：SCXK(沪)2007-0005，饲养于SPF级动物实验室，适应性饲养1周后进行实验。

1.2药物与试剂白藜芦醇(陕西慧科植物开发有限公司，批号：140125，纯度≥98%)；顺铂(山东齐鲁制药有限公司，10 mg/支)；二甲基亚枫(DMSO，美国Sigma公司)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；四甲基偶氮唑盐试剂盒(MTT，美国Sigma公司)；Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(德国Bendermed公司)；bcl-2、bax、caspase-3免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.3主要仪器超净工作台(苏州净化设备一厂)；HF90/HF240 CO2细胞培养箱(香港Heal Force公司)；酶标仪(美国 BIO-RAD公司)；PCR仪(武汉新未来仪器技术有限公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)；倒置光学显微镜(日本Olympus公司)；石蜡切片机(德国SLEE公司)；分析天平(上海天平仪器厂)。

1.4体外实验

1.4.1细胞培养与分组将人上皮性卵巢癌SKOV3细胞株经解冻复苏后置于RPMI-1640培养基中培养，待细胞生长至对数生长期，去培养液后用0.25%胰酶消化，然后用培养液调整细胞密度为5×107L-1接种于96孔板中，培养24 h后随机分为空白组，白藜芦醇40，20，10 μg/mL干预组和顺铂40 μg/mL干预组，各干预组加入相应药物干预48 h。

1.4.2细胞形态学观察干预48 h后，通过倒置光学显微镜观察并比较各组细胞形态差异。

1.4.3细胞增殖抑制率测定干预48 h后，调整细胞浓度为5×107L-1，接种于96孔板，每组设10个复孔，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续平培养4 h后去上清，每孔加入DMSO 200 μL，振荡10 min后通过酶标仪测定波长570 nm处每组细胞吸光度(OD)值，然后通过OD值计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%

1.4.4细胞凋亡状况及凋亡率检测药物干预48h 后，取约1×106个细胞，1 000 r/min离心5 min后弃上清，PBS洗涤，加70%乙醇5 mL混匀，于4 ℃环境放置48 h后，离心去除乙醇，PBS洗涤，用约1 mL PBS溶液打散细胞团后加水解酶Rnase 5 μL(10 mg/mL)，37 ℃环境放置1 h后加入碘化丙啶(100 μg/mL)染液，室温避光孵育30 min，然后通过FACS-FITC和PI联合染色流式细胞仪进行分析检测，采用CELL Quest软件分析各组细胞凋亡状况并计算细胞凋亡率。

1.5体内实验

1.5.1动物模型制备与分组将对数生长期卵巢癌SKOV3细胞调整浓度为2×1010L-1，无菌条件下注射接种于裸鼠右侧背部皮下，每只接种量0.2 mL，7 d后出现>100 mm3皮下结节即认为造模成功。将50只造模成功裸小鼠随机分为模型组，白藜芦醇200，100，50 mg/kg组和顺铂组(2 mg/kg)；模型组灌胃生理盐水，各给药组灌胃相应药物，隔天灌胃1次，共灌胃5次。

1.5.2瘤质量测定及抑瘤率的计算末次灌胃后24 h颈椎脱臼处死小鼠，剖取肿瘤组织，通过电子天平称量肿瘤组织质量，计算抑瘤率，抑瘤率(%)=(模型组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100%。

1.5.3肿瘤组织病理形态学观察将所取肿瘤组织置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，经石蜡包埋、切片、展片处理后，进行常规HE染色，最后通过光学显微镜观察肿瘤组织病理形态学变化。

1.5.4肿瘤组织中bcl-2、bax、caspase-3蛋白表达的检测及半定量分析取制备好的组织石蜡切片，按照试剂盒操作方法步骤，通过免疫组织化学法检测肿瘤组织中bcl-2、bax、caspase-3蛋白表达情况，然后进行半定量分析：每张染色切片随机选取6个视野，通过BI-2000医学图像分析软件测定平均光密度(OD)，取平均值，然后根据bcl-2、bax表达OD值计算bax/bcl-2比值。

2结果

2.1各组SKOV3细胞形态显微镜下观察发现：空白组SKOV3细胞贴壁生长状态良好；而各给药组SKOV3细胞呈现皱缩、形态变圆、数量减少、部分脱落等现象，该现象以白藜芦醇40 μg/mL干预组最为显著。见图1～5。

图1空白组SKOV3细胞形态

图2白藜芦醇10 μg/mL干预组SKOV3细胞形态

图3白藜芦醇20 μg/mL干预组SKOV3细胞形态

图4白藜芦醇40 μg/mL干预组SKOV3细胞形态

2.2各组SKOV3细胞增殖抑制率空白组SKOV3细胞增殖抑制率为0，顺铂40 μg/mL干预组为(43.05±5.92)%，白藜芦醇10 μg/mL干预组为(28.01±6.25)%，白藜芦醇20 μg/mL干预组为(42.58±7.90)%，白藜芦醇40μg/mL干预组为(67.845±8.67)%。白藜芦醇各组细胞增殖抑制率40 μg/mL干预组>20 μg/mL干预组>10 μg/mL干预组, 差异均有统计学意义(P均<0.05)；白藜芦醇40 μg/mL干预组细胞增殖抑制率显著高于顺铂干预组(P<0.05)。

图5顺铂40 μg/mL干预组SKOV3细胞形态

2.3各组SKOV3细胞凋亡状况空白组SKOV3细胞凋亡率为(1.97±1.24)%，顺铂40 μg/mL干预组为(38.15±5.68)%，白藜芦醇10 μg/mL干预组为(15.29±4.72)%，白藜芦醇20 μg/mL干预组为(44.61±7.80)%，白藜芦醇40 μg/mL干预组为(73.27±9.34)%。各给药组SKOV3细胞凋亡率均明显高于空白组(P均<0.05)；白藜芦醇各组细胞凋亡率40 μg/mL干预组>20 μg/mL干预组>10 μg/mL干预组, 差异均有统计学意义(P均<0.05)；白藜芦醇40 μg/mL干预组细胞凋亡率显著高于顺铂干预组(P<0.05)。

2.4各组裸小鼠瘤质量和抑瘤率比较白藜芦醇200，100 mg/kg组和顺铂组瘤质量显著低于模型组(P均<0.05)，且白藜芦醇各组抑瘤率呈剂量依赖性升高(P均<0.05)。见表1。

表1　各组裸小鼠瘤质量和抑瘤率比较±s)

注：①与模型组比较，P<0.05；②与白藜芦醇200 mg/kg组比较，P<0.05；③与白藜芦醇100 mg/kg组比较，P<0.05。

2.5各组裸小鼠肿瘤组织形态学表现模型组荷人上皮性卵巢癌SKOV3细胞呈椭圆形，胞质饱满，胞核增大呈2个或多个，核仁深染；白藜芦醇各组和顺铂组肿瘤细胞呈现皱缩、核染色质边集，并出现不同程度的片状坏死区，以白藜芦醇200 mg/kg组最为显著。见图6～10。

2.6各组裸小鼠肿瘤组织bcl-2、bax、caspase-3蛋白表达情况及bax/bcl-2比值顺铂组和白藜芦醇200，100 mg/kg组肿瘤组织中bcl-2表达量明显低于模型组(P均<0.05)，caspase-3表达量明显高于模型组(P均<0.05)，其中白藜芦醇200 mg/kg组效果最为显著；各给药组bax表达量和bax/bcl-2比值均明显高于模型组(P均<0.05)，白藜芦醇200mg/kg组bax/bcl-2比值显著高于顺铂组(P<0.05)。见表2。各组裸小鼠肿瘤组织bcl-2、bax、caspase-3蛋白IHC染色表现见图11～25。

图6　模型组肿瘤组织形态学表现(HE)

图7　白藜芦醇200 mg/kg组肿瘤组织形态学表现(HE)

图8　白藜芦醇100 mg/kg组肿瘤组织形态学表现(HE)

图9　白藜芦醇50 mg/kg组肿瘤组织形态学表现(HE)

图10　顺铂组肿瘤组织形态学表现(HE)

表2　各组裸小鼠肿瘤组织bcl-2、bax、caspase-3表达

注：①与模型组比较，P<0.05；②与白藜芦醇200 mg/kg组比较，P<0.05；③与顺铂组比较，P<0.05。

图11　模型组肿瘤组织bcl-2蛋白表达表现(IHC)

图12　白藜芦醇200 mg/kg组肿瘤组织bcl-2蛋白表达图(IHC)

图13　白藜芦醇100 mg/kg组肿瘤组织bcl-2蛋白表达图(IHC)

3讨论

卵巢癌是女性生殖系统常见三大恶性肿瘤之一，发病率居第2位；由于早期诊断率低，年病死率约9.5/10万，居妇科恶性肿瘤之首[7]。目前，对于卵巢癌的治疗主要以手术切除联合术后化疗为主，虽能暂时清除并抑制肿瘤细胞，但易复发，其中肿瘤细胞耐药性的产生是导致化疗失败和肿瘤复发的主要原因之一[1]。

图14　白藜芦醇50 mg/kg组肿瘤组织bcl-2蛋白表达图(IHC)

图16　模型组肿瘤组织bax蛋白表达图(IHC)

图17　白藜芦醇200 mg/kg组肿瘤组织bax蛋白表达图(IHC)

图18　白藜芦醇100 mg/kg组肿瘤组织bax蛋白表达图(IHC)

图19　白藜芦醇50 mg/kg组肿瘤组织bax蛋白表达图(IHC)

图20　顺铂2 mg/kg组肿瘤组织bax蛋白表达图(IHC)

图21　模型组肿瘤组织caspase-3蛋白表达图(IHC)

图22　白藜芦醇200 mg/kg组肿瘤组织caspase-3蛋白表达图(IHC)

图23　白藜芦醇100 mg/kg组肿瘤组织caspase-3蛋白表达图(IHC)

图24　白藜芦醇50 mg/kg组肿瘤组织caspase-3蛋白表达图(IHC)

图25　顺铂组肿瘤组织caspase-3蛋白表达图(IHC)

白藜芦醇是一种具有多种药理学活性的多酚类化合物。Lee等[8]研究发现，白藜芦醇在致癌期及癌症早期、发展期、转移期等癌症发生发展的各个阶段均具有抑制作用。郑丽维等[5]通过动物实验研究发现，白藜芦醇有延缓胃癌进展的作用。赵丹懿等[9]研究发现，白藜芦醇能够下调bcl-2蛋白表达并上调细胞因子IL-2、IL-6、IL-12及TNF-α的表达，表现出对肝癌细胞Bel-7402增殖的抑制作用。本实验通过白藜芦醇体外干预人上皮性卵巢癌SKOV3细胞进行研究发现，白藜芦醇能够影响SKOV3细胞生长，显著提高其增殖抑制率和凋亡率。体内实验研究发现，白藜芦醇能够抑制荷人上皮性卵巢癌裸小鼠移植瘤生长，显著提高抑瘤率；观察组织病理切片发现，白藜芦醇还能够诱导肿瘤组织细胞坏死。提示白藜芦醇对体外人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖和荷卵巢癌裸小鼠移植瘤生长均具有抑制作用。

bcl-2家族基因在细胞凋亡过程中起着非常重要的调节作用，其中bcl-2和bax是非常重要的成员，bcl-2为凋亡抑制基因，而bax为促凋亡基因，两者间相互作用、共同调控细胞凋亡[10]；进一步研究发现，细胞凋亡不仅与2种基因的表达密度有关，甚至更依赖于bcl-2/bax比值[11]。caspases基因家族参与细胞凋亡启动、执行整个过程的调节，其中

caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的关键蛋白酶。本研究结果显示，白藜芦醇能够显著下调荷人上皮性卵巢癌裸小鼠肿瘤组织bcl-2蛋白表达，上调bax和caspase-3蛋白表达，提高bax/bcl-2比值，这可能是白藜芦醇抑制荷人上皮性卵巢癌裸小鼠移植瘤生长的重要机制之一。

综上所述，白藜芦醇具有抑制体外人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖及体内荷人上皮性卵巢癌裸小鼠移植瘤生长的作用，其作用机制可能与白藜芦醇能够有效下调bcl-2 蛋白表达、上调bax和caspase-3蛋白表达、提高bax/bcl-2比值有关。

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Inhibition effects of resveratrol on SKOV3 cells proliferation in vitro and xenografts growth in ovarian cancer of nude mice

LI Yan

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the inhibition effects of resveratrol(Res) on SKOV3 cells proliferation in vitro and xenografts growth in ovarian cancer of nude mice. Methods The SKOV3 cells of epithelial ovarian cancer were divided randomly into five groups: normal control group, Res(40, 20, 10 μg/mL) groups and Cisplatin 40 μg/mL group. After intervention for 48 h, the cell morphology were observed by optical microscope, the cellular growth inhibition rate was calculated by MTT, the apoptosis rate were analyzed by flow cytometry. Fifty nude mice models bearing human ovarian cancer were made by injecting inoculation human epithelial ovarian cancer cell line SKOV3 and were divided randomly into five groups: model control group, Res(200, 100, 50 mg/kg) groups and Cisplatin 2 mg/kg group, the drugs were given by intragastric administration(ig) for 5 times. The tumor weight was detected and the inhibition rate was calculated; the histopathological changes of tumor tissue was observed by HE staining; the expression of bcl-2, bax, caspase-3 were detected by IHC and were Semi-quantitative analyzed. Results Compared with normal control group, the morphological of Res(40, 20 μg/mL) groups were abnormalities, the cellular growth inhibition rate was significantly increased(P<0.01), the apoptosis rate was significantly increased(P<0.01). Compared with model control group, the tumor weight of Res (200, 100 mg/kg) groups were significantly decreased and the inhibition rate were significantly increased(P<0.05, P<0.01); necrosis presentation, tumor cell shrinkage and other pathological morphological changes appeared in Res (200, 100 mg/kg) groups; the expression of bcl-2 were significantly decreased, the expression of bax were significantly increased, and the ratio of bax/bcl-2 were significantly increased(P<0.01), the expression of caspase-3 protein were significantly increased(P<0.05, P<0.01). Conclusion Res could effectively inhibit SKOV3 cells proliferation in vitro and xenografts growth in ovarian cancer of nude mice, and the mechanism may be related with its down-regulating the expression of bcl-2 and up-regulating the expression of bax and caspase-3, increasing bax/bcl-2 value.

Key words:resveratrol; ovarian cancer; SKOV3; xenografts

[收稿日期]2015-05-16

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)02-0135-06

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.007

[作者简介]李研，女，主治医师，主要从事妇科肿瘤研究工作。