耐力训练对心肌PERK/eIF2α/ATF4信号通路激活的影响

王蕴红 王智强 刘晓然 陈怡月 李丁丁 余海燕 姚政立

摘要：探讨内质网应激机制在耐力训练对心肌功能影响过程中的作用。方法：通过建立不同运动方式、运动训练状态和不同恢复阶段的动物模型，测定心肌中与内质网应激相关的信号通路PERK/eIF2α/ATF4激活水平的变化。结果：无论是急性运动，还是4 或10周的递增负荷耐力训练，都没有显著激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路，但是以延长运动时间为特征的耐力训练能够激活PERK/eIF2α/ATF4 信号通路。结论：以递增运动时间为特征的耐力训练能够激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路，该通路的激活对运动心肌的结构和功能变化可能产生影响。

关键词： 运动；心肌；内质网应激；蛋白激酶样内质网激酶；真核起始因子2α；转录调节因子4

中图分类号： G 804.2 文章编号：1009783X（2016）03027404 文献标志码： A

Abstract：This study sets to investigate the effect of endurance training on the cardiac muscles，and identify if endoplasmic reticulum stress is involved in the process of functional and structural changes.Methods：We established animal models of different exercise types，training status，and recovery periods in order to study the activation of PERK/eIF2α/ATF4 signaling pathway.Results：Neither a single bout nor 4 or 10 weeks of endurance training induced the activation of PERK/eIF2α/ATF4 signaling pathway.However，duration-increased endurance training significantly activated the activation of PERK/eIF2α/ATF4 signaling pathway.Conclusion：Endurance exercise that characterized with durance increase induced the activation of PERK/eIF2α/ATF4 signaling pathway that might play role in the process of functional and structural changes.

Keywords：exercise；cardiac muscle；endoplasmic reticulum stress；PERK；eIF2α；ATF4

研究显示，耐力训练可激活Akt/mTOR信号通路，引起心肌蛋白质合成提高和心肌肥大[1]；然而长期递增负荷的训练，Akt/mTOR信号通路并没有都显示持续性的激活，心肌也未呈现显著肥大，这提示运动诱发心肌结构的变化还受其他调节机制影响。内质网在蛋白质翻译、折叠、修饰过程中，发挥重要的作用[2]。而当细胞在低氧和营养缺失等因素的作用下，引发内质网应激反应，激活未折叠蛋白反应（UPR），内质网通过UPR起到对细胞的保护作用，这些反应包括暂停早期蛋白质合成、降解[3]。 新近的研究也显示，运动训练可导致骨骼肌内质网应激的发生[4]。那么，在运动训练中的心肌是否会出现内质网应激和UPR？已知信号通路PERK（PKR like ER kinase）/Eukaryotic initiation factor（eIF）2α/Activating transcription factor（ATF）4的激活与内质网应激密切相关[5]；因此，本研究拟通过建立不同训练水平和恢复期，以及不同训练方式的大鼠运动模型，观察PERK/eIF2α/ATF4的激活变化，以揭示内质网应激是否参与了运动诱发的心肌结构变化。

1 研究方法

1.1 实验方法

8周雄性SPF级SpragueDawley大鼠134只，购自北京维通利华实验动物有限公司。本研究采用了2个运动训练方案。第1个运动训练方案（108只大鼠，每组7～10只）是使大鼠分别进行一次递增负荷运动、4周和10周的运动训练。急性运动参照Bedford[6]的运动模型建立；4周和10周的运动训练模型则参照本实验室以往耐力训练模型建立[7]，即起始速度为12 m/min，每周速度递增约3 m/min，10周的运动训练动物在前4周的运动训练方案同4周训练模型，之后继续递增运动速度直到10周训练结束，使10周末速度递增达到34～36 m/min。模型建立后，动物末次运动后在指定时间点（0 h，3 h，24 h）取材，分离左心室。第2个运动方案是建立5周运动训练模型（26只大鼠，每组5～7只），所有运动组大鼠先完成为期3周的速度递增，每天1 h耐力训练后，使运动速度从12 m/min达到24 m/min，再分组进行2周的训练。其中1组（C）维持速度时间不变，而另外2个组则分别进行速度递增（S）、时间递增（D）的运动训练（见表1），运动组大鼠在末次训练后24 h与对照组大鼠（Con）同时处死，取左心室心肌。PERK、pPREK、eIF2α、peIF2α、ATF4、GAPDH 购自Abcam 公司。采用western blot 方法测定心肌相应的指标。

1.2 统计学方法

数据以均数±标准误差表示，采用SPSS统计软件进行双因素方差分析，组间比较采用t检验，检验标准为P<0.05。

2 研究结果

2.1 耐力训练大鼠后心重/体重变化

采用第1个运动方案建立的训练模型中，10周运动组大鼠心重/体重与对照组相比，显著提高，见表2。而采用5周运动训练方案训练的大鼠，只有速度递增组与对照组相比，心重/体重显著升高，见表3。

2.2 急性运动对PERK/eIF2α/ATF4信号通路的影响

结果显示，一次急性运动后，心肌的PERK/eIF2α信号通路的激活水平与相应的对照组比较，没有显著改变，大鼠心肌ATF4的蛋白水平在运动后3 h表达升高（P<0.05），如图1所示。

2.3 4周运动对PERK/eIF2α/ATF4信号通路的影响

经过4周递增速度运动训练后，大鼠心肌信号通路PERK/eIF2α/ATF4的激活水平无明显影响，如图2所示。

2.4 10周运动训练对PERK/eIF2α/ATF4信号通路的影响

结果显示，经过10周递增速度运动训练后，大鼠心肌信号通路PERK/eIF2α/ATF4的激活水平没有明显变化，如图3所示。

2.5 不同运动速度和运动持续时间对PERK/eIF2α/ATF4信号通路的作用

在5周递增运动速度、恒速和递增运动持续时间3种不同的运动方案中，无论是增速、恒速还是延长运动时间的运动训练，pPERK/PERK水平均未发生显著改变。而与此相反，在递增运动速度和递增运动时间的耐力训练后，peIF2α/eIF2α水平都显著提高（P<0.05；P<0.001），延长时间的运动训练比增速运动更高，但是恒速运动与对照组比较，无显著改变。ATF4表达在运动时间递增的耐力训练的心肌，表达显著提高（P<0.05），如图4所示。

3 分析与讨论

内质网是调节细胞蛋白质翻译、折叠、细胞钙离子调控等的重要细胞器，它参与了细胞的应激反应[89]；但以往的研究显示，短期（8周）的中等强度耐力训练对心肌内质网应激蛋白的表达无明显影响[10]，这提示非大强度、大负荷的运动训练过程中心肌内质网应激反应不明显。因而，本研究首先采用了逐渐递增运动速度的模型训练，以达到短期耐力训练及长期耐力训练3个不同的运动状态，观察大鼠心肌恢复期内质网应激相关信号通路PERK/eIF2α/ATF4激活的动态变化，结果显示无论是急性运动，还是4周、10周的训练，PERK/eIF2α都不发生激活变化。进一步说明，较长的训练非极量递增速度的耐力训练，心肌内质网应激也不明显。

然而，进一步研究比较运动速度和运动时间分别增加对心肌内质网信号通路的影响时发现，递增运动速度和递增运动时间的耐力训练，都使peIF2α/eIF2α水平提高，而以延长运动时间的训练提高更明显。心肌ATF4蛋白的表达也是以运动时间延长的耐力运动最为显著，这说明运动负荷的提高，尤其是延长时间的运动训练，可能引起内质网应激信号通路的激活，导致内质网应激的发生。新近研究也显示，运动训练可诱导骨骼肌出现内质网应激，短暂的内质网应激被认为是细胞线粒体内环境稳态改善所必需的，而过度的内质网应激则可能导致肌肉损伤和细胞死亡[11]。

目前，有关内质网应激的发生机制还不十分清楚。有研究显示，在内质网应激相关的信号通路中，PERK所介导的信号通路在诱发心肌细胞凋亡等改变中，较其他诸如 IRE1、ATF6等相关的信号通路起到更为重要的作用[12]。当内质网应激发生时，PERK与内质网分子伴侣GRP78 解离，并通过胞浆内结构域的自身二聚化和磷酸化而激活，激活的PERK使eIF2α发生磷酸化，从而减缓或暂停了蛋白质的合成；同时，磷酸化的eIF2α又选择性地上调ATF4 mRNA的翻译，启动内质网伴侣分子基因转录，以恢复内质网自稳态，有研究显示，内质网应激所诱发的自噬对心肌的缺血再灌注损伤有保护作用[13]。但长期过度内质网应激时，ATF4上调CHOP表达，导致内质网应激相关细胞凋亡[8-9]。实验显示，CHOP和Caspase 12的表达在上述各个运动组中并没有升高，表明该内质网应激并没有导致运动心肌的凋亡；因此，运动诱发内质网应激相关通路激活的生理意义可能在于减少新合成蛋白质进入内质网，进而降低内质网对新蛋白质折叠需求的压力，以便维持细胞稳态。但运动训练中哪些因素诱发心肌内质网应激通路激活，还需要进一步研究。

我们以往的研究也证实，在递增速度的耐力训练中，Akt/mTOR信号通路只出现短期的激活，而随着运动训练强度的逐渐增大，Akt/mTOR信号通路的活性不再提高。有研究显示，PI3K/Akt信号通路对内质网应激蛋白GRP78的表达和稳定性有重要影响[14]。那么，PI3K/Akt信号通路是否参与了运动心肌内质网应激相关信号通路的调节，以及心肌内质网应激降低蛋白质合成是否参与了心肌结构变化的调节，有待进一步研究。此外，我们以往的研究显示，10周递增负荷耐力训练的大鼠心肌自噬标志蛋白表达提高，而运动训练引起自噬的发生与内质网应激是否有关，也需要进一步证实。

4 结论

通过研究不同训练水平及不同方式的耐力运动训练对大鼠心肌内质网应激信号通路PERK/eIF2α/ATF4激活的作用，结果发现：非极量负荷的递增耐力训练不能引起PERK/eIF2α/ATF4信号通路的激活，而以延长时间为特征的耐力训练，能够激活eIF2α/ATF4信号通路。该通路激活的机制对运动心肌的结构和功能的作用，需要进一步加以研究。

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