无患子优选树茎段离体培养体系的建立

邢建宏 冯永涛 黄应德 刘希华

摘要：【目的】筛选无患子茎段离体快繁最佳培养基，建立无患子优良种苗快速繁育体系。【方法】以野外选优获得的无患子树带腋芽茎段为外植体，采用L9（33）正交试验对影响外植体灭菌的HgCl2浓度、HgCl2与酒精的作用时间，不定芽诱导萌发中的6-BA、NAA及蔗糖用量，继代增殖中6-BA与KT用量和芽苗生根中的MS培养基无机盐水平、6-BA和2，4-D用量进行优化。【结果】75%酒精浸泡1 min，再用0.2% HgCl2处理7 min是无患子茎段灭菌的最佳方法，其外植体成活率高达83.33%；MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖是无患子茎段腋芽萌发的适宜培养基，诱导率高达96.67%；MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT是无患子茎段腋芽增殖的适宜培养基，30 d可增殖4.13倍；1/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D是诱导芽苗生根的适宜培养基，平均生根率为41.50%。【结论】建立的无患子离体培养体系为：外植体茎段用75%酒精浸泡1 min，再用0.2% HgCl2灭菌7 min，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖培养基中诱导腋芽萌发，在MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT培养基中进行增殖培养，在1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D培养基中进行生根培养。

关键词： 无患子；茎段；组织培养体系

中图分类号： S722.8 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）11-1903-06

Abstract：【Objective】In this paper， the optimal medium of in vitro rapid propagation was selected in order to establish rapid culture system for Sapindus mukorossi Gaertn seedlings. 【Method】Taking S. mukorossi selective stems with axillary buds as explants，the concentration of HgCl2， action time of HgCl2 and alcohol in explants sterilization， the contents of 6-BA， NAA and sucrose in adventitious bud induction， the dosages of 6-BA and KT in shoot proliferation， and inorganic salt levels in MS， dosages of 6-BA and 2，4-D in seedling rooting was optimized by orthogonal experiment design L9（33）. 【Result】The optimum stem sterilization method for S. mukorossi was as follows： immersing the stem in 75% alcohol for 1 min， and sterilized with 0.2% HgCl2 for 7 min. After this treatment， survival rate of explants was 83.33%. MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L sucrose was the most appropriate culture medium for axillary bud induction， and the induction rate was 96.67%. MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT was the best culture medium for axillary bud proliferation， and the proliferation multiple was 4.13 times after 30 days. 1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D was the best culture medium for rooting，and the average rooting rate was 41.50%. 【Conclusion】The in vitro culture system of S. mukorossi established preliminarily is as follows： immersing the stem explants in 75% alcohol for 1 min， sterilizing them with 0.2% HgCl2 7 min， using medium of MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L sucrose to induce axillary bud germination， putting them in MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT medium for multiplication culture， and using 1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D medium for rooting.

Key words： Sapindus mukorossi Gaertn； stem； tissue culture system

0 引言

【研究意义】无患子（Sapindus mukorossi Gaertn）又名木患子、洗手果、油患子，为无患子科（Sapindaceae）落叶乔木（中国科学院中国植物志编委会，1998），其种仁含油率在40%以上，是生产生物柴油的理想原料（罗艳和刘梅，2007），其假种皮中含37%皂素，是生产农药乳化剂（录丽平等，2010）和纯天然洗涤产品（徐凯节等，2013）的优良原料；果皮提取物具有抗菌防癌功效，在医药保健领域极具开发潜力（Takagi et al.，1980；Tamura和史青，2002）；树形优美，是优良的园林绿化树种和高档用材树种（黄素梅等，2009；周爱红，2011）。近年来，无患子已在台湾、福建及四川等地开始规模化种植，但优质种苗供应严重不足。无患子主要依靠种子实生繁殖（尹道刚等，2011），其后代性状分化较明显，优良性状难以保持，而通过扦插、嫁接等无性繁殖手段的成活率较低（陈碧华等，2012），难以满足生产需求。因此，探讨无患子组培培养技术，对其优良种苗快速繁育及良种选育具有重要意义。【前人研究进展】张凤龙（2005）进行无患子组织培养研究，发现无患子茎段越冬芽是进行组织培养的理想外植体，但所使用的诱导、增殖培养基诱导率和增殖率较低。陈光蓉等（2007）探讨无患子愈伤组织的诱导条件，筛选出叶片愈伤组织诱导培养基为MS（B5）+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，愈伤组织诱导率达97.78%。周倩等（2012）開展无患子愈伤组织诱导与芽苗增殖试验，获得了培养基配方，但未进行继代增殖和生根培养研究。【本研究切入点】前人对野生无患子组织培养的研究多数停留在初代培养技术的探索阶段，诱导率和增殖系数均较低，未能在生产中推广应用，针对经优选获得无患子建立离体培养体系的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】利用选优获得的无患子茎段为材料，探索不经愈伤组织阶段直接诱导腋芽萌动并培养成苗的条件，为无患子优良种苗快速繁育及良种选育提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试无患子树是按照主要指标法对鲜果产量、果皮皂素含量和种仁油脂含量进行初选、复选、决选程序从福建三明市野生无患子中选优获得。在连续3 d晴天的中午剪取生长健壮、无病虫害的当年生半木质化枝条作外植体。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 外植体灭菌 将采回的枝条去除叶片后剪成5～6 cm长带腋芽茎段，用洗衣粉溶液和多菌灵溶液分别浸泡30 min，自来水漂洗2～3 h，在超净工作台上将其剪成约1 cm长的带腋芽茎段，用75%酒精和一定浓度HgCl2溶液进行消毒（设8个灭菌处理，试验设计见表1），并用无菌水冲洗5～6遍后接种。每处理设3次重复，每个重复接种20个外植体（下同）。

1. 2. 2 外植体启动培养基筛选 在预试验基础上，以MS为基本培养基，以6-BA、NAA和蔗糖3个因素为参选因素，采用3因素3水平正交试验设计9种诱导培养基，筛选无患子茎段诱导的最佳培养基组分。

1. 2. 3 增殖培养基筛选 选取诱导获得生长健康、高2～3 cm的腋芽进行增殖培养。以MS为基本培养基，设计9种增殖培养基，筛选适宜无患子腋芽增殖的6-BA和KT浓度。

1. 2. 4 生根培养基筛选 挑选增殖培养获得不定芽中健壮的芽体接种于生根培养基上进行生根培养。以MS培养基无机盐水平、6-BA和2，4-D用量为参选因素，应用3因素3水平正交试验设计9种生根培养基，筛选适宜芽苗生根的培养基。

除启动培养基外，上述培养基均附加7.0 g/L琼脂和30.0 g/L蔗糖，pH 5.8，121 ℃灭菌20 min。接种苗培养温度为（26±2）℃，光照强度为2000～3000 lx，光照时间为12 h/d。

1. 3 统计分析

试验数据采用Excel 2003和DPS 7.05进行统计分析。诱导率和生根率數据先进行平方根反正弦转换后再根据正交试验统计模型进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 无患子茎段外植体灭菌方法的筛选

由表1可知，灭菌处理4（75%酒精浸泡1 min，0.2% HgCl2处理7 min）是理想的外植体灭菌处理，其成活率最高，为83.33%，显著高于其他7个灭菌处理（P<0.05，下同）；其污染率较低，为3.88%，显著低于处理1和2，与灭菌处理3、5、6、7和8差异不显著（P>0.05，下同）。说明HgCl2的灭菌效果优于酒精。由表1还可看出，无患子带腋芽茎段适宜的HgCl2和75%酒精灭菌时间分别为7～9和1 min。说明通过延长酒精处理时间和提高HgCl2质量浓度来缩短HgCl2灭菌时间，可减轻消毒液对外植体的毒害作用，从根本上提高成活率。

2. 2 无患子茎段启动培养基的筛选

为了减少诱导培养中的污染，在外植体接种3 d后，将无污染的茎段转接于不同组分MS培养基中，30 d后观察生长状况，统计诱导率，并进行极差分析和方差分析。由表2可知，诱导培养基8（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖）的诱导率最高，达96.67%，显著高于诱导培养基1～6；芽开始分化时间较短，为4.33 d，比诱导培养基3、5和9略长，但差异不显著。对比极差分析结果中3个因素的k可知，茎段启动培养基中各因素最优组合为A3B2C1，从R大小可知，3个因素对诱导率影响的排为A>B>C，即3个因素对无患子腋芽诱导作用的强弱为6-BA>NAA>蔗糖，其最佳浓度组合为诱导培养基8中的组合。3个因素对无患子茎段腋芽诱导率的方差分析结果（表3）显示，6-BA对无患子茎段腋芽的诱导作用达显著水平（P=0.0354<0.05），NAA和蔗糖的作用未达显著水平。综上所述，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖是适宜无患子茎段离体培养的启动培养基。

2. 3 无患子茎段腋芽增殖培养基的筛选

在丛生芽长至2～3 cm高时，将其切成单芽接种于增殖培养基上继代培养，30 d后统计增殖倍数和苗高。由表4可知，增殖培养基2（MS+0.7 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L KT）的增殖效果最佳，培养30 d增殖了4.13倍，显著高于增殖培养基1、4和7；其苗高达3.10 cm，显著高于增殖培养基1、4和7，略低于培养基3，但差异不显著。6-BA和KT对无患子茎段腋芽增殖倍数的方差分析结果（表5）显示，KT对丛生芽的继代增殖作用达显著水平（P=0.0232<0.05），6-BA对丛生芽的继代增殖作用未达显著水平。对继代苗生长性状进行观察发现，培养基2中腋芽接种3 d左右茎尖膨大形成小芽点，7 d左右单芽基部不断有新的不定芽产生，18～20 d在小芽基部一般有2～4个丛生芽，30 d增殖系数达高峰，且芽健壮、叶片较绿。说明MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT是适宜无患子茎段腋芽增殖的培养基。

2. 4 无患子茎段腋芽增殖苗生根培养基的筛选

选取生长一致、高度大于3.00 cm的增殖苗单个转接于生根培养基上，培养约15 d芽体基部可见细小不定根根尖长出，20 d时不定根分化达到高峰，30 d 时不定根由白色变为灰色。9种生根培养基上增殖苗生根情况见表6。

由表6可知，无患子增殖苗在9种生根培养基中生根情况差异明显，其中在生根培养基7（1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D）中生根率最高，为41.50%，显著高于其他8种生根培养基；生根数较多，为2.63条，显著多于生根培养基2、3、5、6、8和9，少于生根培养基1但差异不显著；根长达3.71 cm，显著长于生根培养基2、3、5、6、8和9；生根时间最早，为12.33 d，显著早于除生根培养基4外的其他生根培养基。对比生根率极差分析结果（表6）中3个因素的k可知，生根培养基中各因素最优组合为A3B1C3，从R大小可知，3个因素对诱导率影响的排序为B>A>C，即3个因素对无患子茎段腋芽增殖苗生根作用强弱为6-BA浓度>MS培养基无机盐水平>2，4-D浓度，生根培养基7的组合为3种因素的最佳组合。对生根率、生根数、根长和最早生根时间的方差分析结果（表7）表明，6-BA浓度对生根率、生根数和最早生根时间的影响达极显著水平（P分别为0.0036、0.0046和0.0078，均小于0.01），对根长的影响达显著水平（P=0.0151<0.05）；MS培养基无机盐水平对生根率、生根数和最早生根时间的影响达显著水平（P分别为0.0186、0.0396和0.0385，均小于0.05），对根长的影响不显著。

无患子茎段诱导及植株再生过程见图1。

3 讨论

获取无菌材料是木本植物组织培养成功的重要环节，选择适宜的季节和天气采集外植体并选用合理的消毒方法是降低污染、提高诱导成活率的关键（王蒂，2004）。本研究中无患子优选树生长于野外，在晴天上午采集靠近树体基部春季新萌发的嫩枝作外植体，从选材方面为减少外植体污染、提高成活率打下了基础。

周倩等（2012）的研究结果表明，无患子1年生幼苗茎段用75%酒精浸洗30 s后再用0.1% HgCl2浸泡4～5 min的灭菌效果最佳。樊靖等（2014）研究认为，无菌存活率在受外植体影响的同时，还受到消毒剂种类、浓度及消毒时间的影响。与上述研究结果相比，本研究优化了适合成年无患子树茎段消毒的酒精和HgCl2浓度及其作用时间，筛选出用75%酒精浸泡外植体1 min、重复3次，再用0.2% HgCl2处理7 min为最佳灭菌方式。

本研究发现，在无患子茎段诱导培养中6-BA对腋芽的诱导作用明显，与Hagen和Guilfoyle（2002）、陈光蓉等（2007）的研究结果一致，并筛选出MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖为无患子茎段萌发的最佳培养基。

周权男（2014）研究认为，植物生长调节物质可促进试管苗形成不定芽，在增殖中起决定性作用。本研究发现，KT对无患子茎段腋芽的继代增殖作用明显，与乔梦吉（2013）等对木本植物灰木莲组织培养的研究结果一致，并认为MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT是无患子茎段腋芽增殖的适宜培养基。本研究还发现，无患子丛生芽在继代培养约30 d后，基部会产生愈伤组织，严重影响芽体对营养的吸收，導致生长不良。因此，无患子茎段腋芽的继代增殖时间应控制在30 d内，以减少芽基部愈伤组织的形成，提高继代增殖效率。

林杰等（2013）的研究结果显示，MS培养基的无机盐水平和6-BA浓度对经叶片愈伤组织诱导获得的无患子丛生芽生根有显著影响；张卫华等（2014）研究认为，木本植物较难生根，而在1/2MS中配合使用IBA和NAA可提高生根率。本研究结果与其相似，在MS培养基无机盐水平下配合使用6-BA和2，4-D对无患子茎段诱导获得的增殖苗生根影响显著，1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D是无患子增殖苗生根的最佳培养基。本研究虽然获得了生根苗，但还需在此基础上对无患子茎段离体快繁体系进一步优化，以满足无患子优良无性系工厂化快繁的要求。

4 结论

本研究建立了无患子优树茎段离体培养体系，即无患子茎段在75%酒精浸泡1 min，再用0.2% HgCl2灭菌7 min灭菌效果较佳，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖培养基中诱导腋芽萌发率最高，在MS+0.7 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT培养基中进行增殖培养增殖倍数最大，在1/3MS+0.5 mg/L 6-BA+0.7 mg/L 2，4-D培养基中进行生根培养生根率最高。

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（责任编辑 思利华）