鲁枣3号茎段不定芽诱导研究

孙清荣 孙洪雁 周广芳

摘要：为了建立枣优良新品种鲁枣3号的茎段不定芽再生体系，以其幼嫩茎段为外植体，研究了不同基本培养基和植物生长调节剂对茎段愈伤组织诱导及不定芽再生的影响。结果表明：基本培养基WPM比MS显著提高了愈伤组织诱导率，WPM上的愈伤组织诱导率达100%，但不能诱导愈伤组织产生不定芽。TDZ对不定芽的再生比6-BA更有效，成功诱导愈伤组织获得了14.9%的不定芽再生率，而6-BA未能诱导愈伤组织产生不定芽。鲁枣3号茎段适宜的不定芽再生培养基为：MS+lmg/L TDZ+0.2mg/L IBA。

关键词：鲁枣3号；茎段；愈伤组织；不定芽

中图分类号：S665.101

文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）02-0012-03

枣（Zizyphus juijuba Mill.）是鼠李科枣属多年生落叶木本果树，原产地中国。红枣营养丰富、富含维生素，深受广大消费者喜爱，但由于枣树在生长过程中经常受到一些病虫害危害，制约了红枣产量。通过育种方法可以进行枣树品种的抗性改良，但由于枣胚败育率高及落花落果严重等，利用常规杂交育种方法很难达到品种改良的目的。基因工程的外源基因遗传转化技术及植物体细胞诱变技术等现代生物技术方法的发展为植物新品种的选育和改良提供了育种新途径，该技术的成功应用主要依赖于植物高效再生体系的建立。因此，建立枣树的高效再生体系是利用现代生物技术手段改良品种的首要步骤。

枣离体叶片不定梢诱导研究报道较多，但以枣嫩茎切段为外植体进行不定芽诱导的研究尚未见报道。鲁枣3号是2010年山东省审定的极早熟鲜食枣新品种，为了更好地利用、保存和改良这一品种，本试验研究了其茎段不定芽再生技术，为种苗的无性快繁、品种资源的离体保存及利用现代生物技术改良品种奠定基础，同时也为其他品种茎段不定芽再生诱导研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山东省果树研究所枣树资源圃种植的枣树新品种鲁枣3号成年大树。

1.2 培养基

愈伤组织及不定芽诱导培养基：以MS和WPM为基本培养基，添加不同浓度的6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、噻苯隆（TDZ）及3-吲哚丁酸（IBA），设置4种不同培养基处理（表1）。

不定芽的增殖培养基：WPM+2mg/L6-BA+1mg/LKT+0.5mg/L IBA。

生根培养基：1/4MS+1mg/L IBA。

所有培养基均添加蔗糖3%，琼脂0.6%，在灭菌前调节pH值为5.8。

1.3 试验方法

1.3.1 愈伤组织诱导及不定芽分化培养 从生长健壮的鲁枣3号树上剪取半木质化枣头嫩枝，去掉叶片，带回实验室，剪取去掉两端腋芽的节间茎段，用洗衣粉水清洗，再用自来水冲洗30min以上，控净水，置于超净工作台上的无菌烧杯内。先用70%酒精杀菌1min，再用5%次氯酸钠杀菌8min，期间摇动3-5次，用无菌水洗4～5次，将材料置于无菌培养皿内横切成0.2cm左右的小段，横切面向下接种到不定芽诱导培养基上（表1）。每个处理接种3瓶，每瓶接种10个，重复3次。接种后置于光周期为16h/8h（光/暗）、光强为40μmol·m-2·S-l、温度为（25+2）℃的条件下培养，7周后，统计愈伤组织诱导率及不定芽再生率。

愈伤组织诱导率（%）=产生愈伤组织的茎段数/接种总茎段数xl00

不定芽再生率（%）=产生不定芽的茎段数/接种总茎段数×100

1.3.2 不定芽伸长、增殖和生根培养将不定芽转移到增殖培养基进行继代增殖和伸长培养。选取1.0cm以上的健康绿梢，转移到生根培养基进行生根诱导，置黑暗条件下培养1周，然后转到光周期为16h/8h（光/暗）的光培养条件下培养，4周后统计生根率。

生根率（%）=生根株数/接种总梢数×100

1.4 数据分析

试验数据采用DPS 7.5软件进行统计分析，不同处理平均值用LSD法进行差异比较分析，检验0.05水平下差异显著性。

2 结果与分析

2.1 培养基组成对愈伤组织诱导率的影响

由表1可知，4种培养基均可诱导鲁枣3号茎段产生愈伤组织，其中WPM基本培养基处理的愈伤组织诱导率可达100%，显著高于MS基本培养基。

外源植物生长调节剂对愈伤组织的诱导作用因基本培养基的不同而表现不同。在WPM培养基上，TDZ和6-BA对愈伤组织的诱导作用无明显差异；在MS培养基上，TDZ比6-BA对愈伤组织的诱导更有效，二者的愈伤组织诱导率差异显著（表1）。

2.2 培养基组成对不定芽分化的影响

由表1可知，WPM培养基上的愈伤组织均未能分化不定芽。在MS基本培养基上添加1mg/LTDZ和0.2mg/L IBA时，可成功诱导愈伤组织分化不定芽（图1A），不定芽再生率为14.9%；而添加6-BA的MS培养基未能诱导愈伤分化不定芽。由此可见，不定芽的分化受基本培养基和外源植物生长调节剂相互作用的影响。尽管WPM能高效诱导愈伤组织的产生，但不能诱导愈伤组织产生不定芽。结果表明，诱导鲁枣3号茎段不定芽再生的适宜培养基为MS+lmg/L TDZ+0.2mg/L IBA。

2.3 不定芽的生长与增殖

将不定芽转移至培养基WPM+2mg/L 6-BA+1mg/L KT+O.5mg/L IBA培养基上，表现为既有伸长生长也有增殖生长（图1B）。

2.4 生根诱导

伸长生长的不定梢在生根培养基上获得了生根小植株（图1C），生根率为85.4%。

3 结论与讨论

以枣树叶片为外植体进行不定梢诱导的研究报道较多，但因基因型不同，其获得的再生率也不同。茎段不定芽再生的研究虽也有报道，但所用外植体为带芽茎段，表现为在切口处产生不定芽。本研究是以节间（去掉两端芽）茎段为外植体，首次成功获得了再生不定芽。

本研究中，基本培养基WPM比MS虽然显著提高愈伤组织诱导率，但WPM培养基上添加TDZ或6-BA均未获得不定芽再生，而在MS培养基上添加TDZ成功获得了不定芽，这与前人在MS培养基上获得带芽枣茎段不定芽再生的结论相一致，但所添加的植物生长调节剂不同，表明外植体或基因型不同，不定芽再生所需的植物生长调节剂不同。

TDZ是比6-BA细胞分裂素活性更强的类细胞分裂素物质，更有利于诱导木本植物不定芽的再生。本研究结果表明：TDZ对于诱导鲁枣3号茎段的不定芽再生比6-BA更有效，这与诱导枣叶片不定芽再生时TDZ比6-BA有效的研究结果一致。

本研究虽成功获得了鲁枣3号茎段不定芽的再生，但再生率低，不能有效应用于生物技术育种研究，如何进一步提高再生率还需深入研究。