山豆根多糖对PRRSV感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子的影响

张玲 李飞 韦英益 何家康 陈海兰 胡庭俊 廖玲玲

摘要：【目的】探讨山豆根多糖（SSP）对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）体外感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子水平的影响，为研发出治疗猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的新型兽药提供参考依据。【方法】以50、100、200和400 μg/mL SSP作用于PRRSV体外感染8 h的RAW264.7细胞，通过MTT法评价SSP对PRRSV感染RAW264.7细胞存活率，ELISA检测SSP对PRRSV体外感染RAW264.7细胞培养上清液中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1。【结果】PRRSV感染RAW264.7细胞8 h极显著降低了细胞存活率（P<0.01，下同），而200～400 μg/mL SSP能极显著升高PRRSV感染RAW264.7细胞存活率。PRRSV感染RAW264.7细胞8 h可极显著升高细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平，而SSP能有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌上述炎性因子水平，其中以200～400 μg/mL SSP的抑制效果最佳。【结论】SSP通过提高炎症细胞存活率及抑制其分泌炎性因子水平，从而有效干预PRRSV感染免疫细胞的炎性反应。

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）；山豆根多糖；RAW264.7细胞；存活率；炎性因子

中图分类号： S858.28 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）12-2151-06

Abstract：【Objective】The present study investigated effects of Sophora subprostrate polysaccharide（SSP） on cell viabilities and inflammatory cytokines of RAW264.7 cells infected by porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） in vitro， in order to provide reference for developing new veterinary medicine curing PRRSV. 【Method】SSP was applied to RAW264.7 cells infected with PRRSV in vitro for 8 hours at dose of 50， 100， 200 and 400 μg/mL. Cell viabilities in SSP treated RAW264.7 cells infected by PRRSV in vitro were evaluated by MTT method. ELISA method was used to detect levels of inflammatory cytokines in culture supernatant of RAW264.7 cells， including TNF-α， IL-1β， IL-6， IL-8， IL-10 and MCP-1. 【Result】After eight hours of PRRSV infection， viabilities of RAW264.7 cells were significantly reduced（P<0.01，the same below）； 200-400 μg/mL SSP treatment significantly increased cell viabilities of RAW264.7 cells infected by PRRSV. The levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， IL-8， IL-10 and MCP-1 were significantly increased in RAW264.7 cells infected with PRRSV. SSP treatment decreased levels of these inflammatory cytokines， and 200～400 μg/mL SSP had the best inhibiting effects. 【Conclusion】SSP can increase cell viabilities and reduce inflammatory cytokine levels in RAW264.7 cells infected by PRRSV， so as to intervene inflammatory response of immune cells infected by PRRSV.

Key words： porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）； Sophora subprostrate polysaccharide； RAW264.7 cell； viability； inflammatory cytokine

0 引言

【研究意义】猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）属尼多病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，为RNA病毒。该病毒感染引发的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）主要表现为母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状和机体免疫抑制（谭业平等，2014），给世界养猪业造成巨大经济损失。PRRSV感染可引起强烈的间质性肺炎，表明炎症反应在PRRSV感染和致病性方面扮演着十分重要的角色（宋爽，2013）。病毒感染常导致动物机体处于氧化应激状态，并促使机体产生过量的促炎细胞因子（Azevedo et al.，2006；Chen et al.，2012）。因此，掌握PRRSV感染的内在规律，对寻找和研发出理想的抗病毒感染药物具有重要意义。【前人研究进展】RAW264.7细胞作为单核/巨噬细胞常被应用于病毒感染模型研究。Lin等（2012）以伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染RAW264.7細胞模拟单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）感染诱导炎症的情况，发现β-类胡萝卜素能显著抑制PRV诱导RAW264.7细胞NO、IL-1β、IL-6、MCP-1的产生及NF-κB（p50和p65）、ERK、p38、JNK的表达，表明β-类胡萝卜素通过抑制PRV诱导炎症细胞因子的表达而起到抗炎作用。近年来，各国学者先后从多种生物体内提取出大量的生物活性多糖，并证实这些生物多糖结构复杂，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节等功能活性，且低毒、低残留（Shao et al.，2004；Chang et al.，2010）。生物多糖能够增强巨噬细胞的增殖活性，促进NO、H2O2等活性因子的产生及调节MCP-1、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10等细胞因子的释放，从而调节巨噬细胞的免疫功能（Winzler et al.，1997）。李智军（2000）对系膜增生性肾小球肾炎大鼠模型的研究发现，黄芪多糖可降低大鼠血液及尿液中的IL-6含量，抑制系膜细胞增生和基质增多，具有抗炎保护作用。Yuan等（2008）研究发现，黄芪多糖对非肥胖性糖尿病小鼠胰岛β细胞中INF-γ、IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子的表达有明显的下调作用，说明黄芪多糖可纠正Th1型细胞因子的免疫失衡状态，从而预防糖尿病发生（Qiu et al.，2010）。Su等（2013）研究表明，山豆根多糖在50～800 μg/mL浓度范围内对体外培养RAW264.7细胞存活率无显著影响。【本研究切入点】目前，国内外针对PRRSV诱导猪体内炎症反应，特别是PRRSV诱导促炎细胞因子的产生已有许多研究报道（冯丽丽，2009；郝祝兵，2014），但尚未研发出有效的治疗药物。多糖类药物可从多方面对免疫系统发挥调节作用，从而提高机体抗炎和抗病毒感染能力，但有关生物多糖是否对PRRSV感染引发的炎症反应具有抗炎作用尚需进一步探究。【拟解决的关键问题】探讨山豆根多糖（Sophora subprostrate polysaccharide，SSP）对PRRSV体外感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子水平的影响，为研发出治疗PRRS的新型兽药提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

山豆根多糖（SSP）为灰白色粉末状，由广西大学动物科学技术学院药理实验室采用水提醇沉法提取并精制获得，经苯酚硫酸法测得总糖含量为88.48%。SSP溶液：准确称取SSP溶解于10% FBS-DMEM培养液，调节至所需浓度，用0.22 μm滤膜过滤，现配现用。PRRSV-GXA株毒株由广西大学动物科学技术学院基础药理实验室保存提供，经非洲绿猴肾传代细胞（Marc-145）增殖后测得病毒滴度为10-5.6 TCID50/0.1 mL，用时调节至PRRSV体外感染RAW264.7细胞氧化胁迫模型稀释度（100倍稀释）。RAW264.7细胞由广西大学动物科学技术学院基础药理实验室分离并冻存。南美洲胎牛血清（FBS）经56 ℃水浴灭活30 min，用0.22 μm滤膜过滤后-20 ℃冻存备用；DMEM干粉、RPMI- l640干粉购自美国Gibco公司；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等ELISA检测试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司；脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、噻唑蓝（MTT）、双抗（P/S）、谷氨酰胺、胰蛋白酶等均购自美国Sigma公司。主要仪器设备：Multimode Plate Reader多功能酶标仪（PerkinElmer，瑞士）、TS100-F倒置显微镜（尼康，日本）、C150细胞培养箱（Binder，德国）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 MTT法检测RAW264.7细胞活性 设空白对照（CK）、SSP 400 μg/mL、SSP 200 μg/mL、SSP 100 μg/mL、SSP 50 μg/mL、PRRSV+SSP 400 μg/mL、PRRSV+SSP 200 μg/mL、PRRSV+SSP 100 μg/mL、PRRSV+SSP 50 μg/mL、LPS、PRRSV共11个处理组，每组6孔重复。

取传代生长良好的RAW264.7细胞进行细胞计数，调节其浓度至1×105 cell/mL铺于96孔板中，100 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，弃上清液，各病毒组加入PRRSV液（100 μL/孔），非病毒组加入等量的无血清DMEM，37 ℃、5% CO2培养2 h，每15 min摇匀1次。弃上清液，多糖组分别加入不同浓度的山豆根多糖（200 μL/孔），LPS组加入1 μg/mL LPS（200 μL/孔），空白对照组、病毒对照组则加入等量的10% FBS-DMEM培养液。37 ℃、5% CO2培养4 h，吸出20 μL上清液后加入20 μL的5 mg/mL MTT继续培养，4 h后弃上清液，加入100 μL DMSO振荡，室温避光静置10 min，以Plate Reader多功能酶标仪检测OD570 nm（刘民等，2005；赵嘉惠等，2007）。

1. 2. 2 ELISA检测RAW264.7细胞分泌炎性因子水平 设空白对照（CK）、PRRSV+SSP 400 μg/mL、PRRSV+SSP 200 μg/mL、PRRSV+SSP 100 μg/mL、PRRSV+SSP 50 μg/mL、LPS、PRRSV共7个处理组，每组4孔重复。

传代生长良好的RAW264.7细胞调节至1×106 cell/mL铺于24孔板中，1000 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2培养12 h。细胞贴壁后，弃上清液，病毒组加入PRRSV液（200 μL/孔），空白对照组加入10% FBS- DMEM（200 μL/孔），LPS组加入1 μg/mL LPS（200 μL/孔），37 ℃、5% CO2培养2 h，每15 min摇匀1次。弃上清液，多糖组加入不同浓度的山豆根多糖（1000 μL/孔），LPS组加入1 μg/mL LPS（1000 μL/孔），空白对照组、病毒对照组则加入等量的10% FBS-DMEM培养液。37 ℃、5% CO2培养8 h后收集细胞培养上清液，以ELISA试剂盒检测炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平，并根据标准曲线计算其含量。

1. 3 统计分析

试验数据采用SPSS 22.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并以Duncans进行组间比较分析。

2 结果与分析

2. 1 RAW264.7细胞存活率测定结果

由表1可知，经50、100、200、400 μg/mL SSP分别处理8 h后RAW264.7细胞存活率未出现下降趋势，反而呈升高趋势，其中100、200和400 μg/mL SSP处理的RAW264.7细胞存活率极显著高于空白对照组（P<

0.01，下同）。PRRSV感染RAW264.7细胞8 h后能有效降低细胞存活率，与空白对照组相比差异极显著，但加入SSP处理8 h后RAW264.7细胞存活率均有所回升，其中200和400 μg/mL SSP能极显著提高PRRSV感染RAW264.7细胞存活率，100 μg/mL SSP能显著提高PRRSV感染RAW264.7细胞存活率（P<0.05，下同）。

2. 2 RAW264.7细胞分泌炎性因子水平测定结果

2. 2. 1 TNF-α水平测定结果 由表2可知，PRRSV感染RAW264.7细胞8 h可明显升高细胞分泌TNF-α水平，与空白对照组相比差异极显著。加入不同浓度SSP处理8 h后，发现SSP能有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌TNF-α的能力。其中，100 μg/mL SSP能显著降低PRRSV感染RAW264.7細胞分泌TNF-α水平，200和400 μg/mL SSP能极显著降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌TNF-α水平。

2. 2. 2 IL-1β水平测定结果 由表2可知，PRRSV感染RAW264.7细胞8 h可升高细胞分泌IL-1β水平，与空白对照组相比差异显著。加入不同浓度SSP处理8 h后，发现SSP能有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-1β的能力。其中，以200和400 μg/mL SSP的效果最明显，使PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-1β水平接近于空白对照组，而与病毒对照组（PRRSV）相比差异极显著。

2. 2. 3 IL-6水平测定结果 PRRSV感染RAW264.7细胞8 h可极显著升高细胞分泌IL-6水平（表2），但加入不同浓度SSP处理8 h后，PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-6水平明显下降。其中，200 μg/mL SSP能显著降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-6水平，400 μg/mL SSP能极显著降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-6水平。表明SSP能有效抑制PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-6的能力。

2. 2. 4 IL-8水平测定结果 由表2可知，PRRSV感染RAW264.7细胞8 h可极显著升高细胞分泌IL-8水平，但加入不同浓度SSP处理8 h后，发现SSP能有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-8水平。其中，50～100 μg/mL SSP能在一定程度上降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-8水平，但与病毒对照组（PRRSV）相比差异不显著（P>0.05，下同）；200和400 μg/mL SSP能极显著降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-8的能力。

2. 2. 5 IL-10水平测定结果 由表2可知，PRRSV感染RAW264.7细胞8 h可极显著升高细胞分泌IL-10水平，但加入不同浓度SSP处理8 h后，PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-10水平得到有效抑制。其中，50 μg/mL SSP能在一定程度上降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-10水平，但与病毒对照组（PRRSV）无显著差异，100、200和400 μg/mL SSP能极显著降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-10水平。

2. 2. 6 MCP-l水平测定结果 由表2可知，PRRSV感染RAW264.7细胞8 h可极显著升高细胞分泌MCP-l水平，但加入不同浓度SSP处理8 h后，发现100、200和400 μg/mL SSP能极显著降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌MCP-l水平，表明SSP能有效抑制PRRSV感染RAW264.7细胞分泌MCP-l的能力。

3 讨论

PRRSV主要感染机体肺脏及一些淋巴器官，其宿主细胞是巨噬细胞，包括各种未成熟或已分化的巨噬细胞。肺泡巨噬细胞来自单核巨噬细胞系，由单核细胞系定居在组织中分化而来（Lamontagne et al.，2003）。作为一种贴壁生长的单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞具有转染稳定的特点，已被广泛应用于医学研究领域（Pang et al.，2010）。本研究结果表明，PRRSV感染RAW264.7细胞8 h后极显著降低细胞存活率，但加入不同浓度SSP处理8 h后，尤其是经200和400 μg/mL SSP处理的PRRSV感染RAW264.7细胞存活率极显著升高，提示一定浓度的SSP能有效降低PRRSV感染引起的细胞死亡，进而提高免疫细胞的存活率。

TNF-α作为巨噬细胞分泌的最重要促炎细胞因子，能够刺激巨噬细胞活化并诱导其他促炎细胞因子分泌（Bradley，2008）。TNF-α可活化T、B淋巴细胞和巨噬细胞，并通过与受体TNFR1结合诱导产生黏附分子和其他细胞因子。IL-1β主要是由淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞产生的一种促炎细胞因子，是机体调节免疫与炎症反应的重要核心介质，在炎性反应中发挥重要作用（贾文思等，2013）。Liu等（2009）研究表明，猪肺泡巨噬细胞感染PRRSV后诱导分泌产生的IL-1β大量增多。而毛予龙等（2012）研究发现，甘草酸苷可通过降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6等含量来增强细胞的抗炎能力，进而发挥抗病毒作用。本研究发现，PRRSV感染RAW264.7细胞8 h可极显著升高细胞分泌TNF-α和IL-1β水平，而SSP能有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-1β的能力，其抑制作用随多糖剂量的增加而增强。

IL-6作为一种多效的细胞因子，参与调节多种生物进程，包括炎症与免疫应答、应激反应、造血系统、神经系统等（Hirano，2009）。当机体发生炎症或其他病变时，单核细胞和巨噬细胞是最早产生IL-6的反应细胞（Hirano et al.，1990）。在通常情况下，IL-6与TNF-α和IL-1β一同产生，参与调节炎症反应（Rachman and Rinaldi， 2006； Sakakibara and Tosato，2011）。Liu等（2009）研究发现，8周龄仔猪在感染PRRSV后第7 d，猪肺泡巨噬细胞分泌大量IL-6。张海等（2014）研究表明，巴马汀可明显抑制LPS诱导RAW264.7细胞IL-6的生成，表现出较强的抗炎作用。本研究发现，200 μg/mL SSP可显著降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-6水平，400 μg/mL SSP可极显著降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-6水平。

趋化因子家族中两个重要成员（IL-8和MCP-1）与炎症反应过程密切相关（Braganhol et al.，2015；Crucitti et al.，2015；Deng et al.，2015）。IL-8是一种多功能的细胞因子，在病毒感染引发的炎症反应中发挥着重要的调节作用（何青，2015）。Ait-Ali等（2007）研究发现，PRRSV感染长白猪和皮特兰猪2 h后，其肺泡巨噬细胞中的 IL-8 水平急剧增高，且呈稳步上升趋势；值得注意的是，长白猪巨噬细胞易感PRRSV的程度没有皮特兰猪强，其IL-8的分泌量亦低于皮特兰猪，说明IL-8是巨噬细胞对PRRSV感染的一种免疫应答。MCP-1是趋化因子家族CC亚族成员，同属成员有5种（MCP-l、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5）。MCP-1作为一种能促进机体内炎症微环境形成的细胞因子，与免疫应答过程及多种病理变化的发生和发展密切相关（Miotto et al.，2007）。仲芳等（2009）研究发现，姜黄素可抑制LPS诱导肾小管上皮细胞IL-8和MCP-1的表达水平，提示姜黄素在肾脏炎症过程中具有抑制肾小管上皮细胞炎性因子分泌及潜在的抗纤维化作用。在本研究中，PRRSV感染RAW264.7細胞8 h可极显著升高细胞分泌IL-8和MCP-1水平，而200～400 μg/mL SSP可极显著降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-8和MCP-1水平。

IL-10是一种对多种细胞均有影响的多功能细胞因子，可由多种细胞产生，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核/巨噬细胞、成熟的树突状细胞等（Flores-Mendoza et al.，2008）。大多数病毒感染机体后均能引起IL-10高水平表达，一些病毒还通过编码与IL-10同源的蛋白，借助其免疫抑制特性促进病毒感染（Redpath et al.，2001；Breen，2002）。另外，IL-10作为一种多效性细胞因子被普遍认为在PRRSV免疫学与病理学中发挥关键作用。在LPS刺激RAW264.7细胞释放炎性因子模型中，人工麝香水提物可明显降低炎性因子IL-10的释放，即人工麝香具有显著的抗炎免疫调节活性（孟迂等，2014）。本研究结果表明，100～400 μg/mL SSP可极显著降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌IL-10水平。

4 结论

本研究结果表明，适量的SSP能有效提高PRRSV感染RAW264.7细胞存活率及降低其分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10及MCP-1水平，即SSP通过提高炎症细胞存活率及抑制其分泌炎性因子水平，从而有效干预PRRSV感染免疫细胞的炎性反应。

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（責任编辑 兰宗宝）