蚕沙纤维素降解菌HB—2菌株的分离、鉴定及酶活性分析

岑贞陆 胡钧铭 韦仕岩 何铁光 李婷婷 曾泉

摘要：【目的】筛选蚕沙纤维素降解菌株，为蚕沙无害化快速腐熟处理提供优质菌种。【方法】以蚕沙为材料，利用 CMC-Na培养基分离蚕沙纤维素降解菌，通过形态学、生化特征和16S rDNA序列测定方法等对分离获得的纤维素降解菌进行分类学鉴定，并研究碳源、氮源、pH、培养时间和培养温度对分离菌株产酶活力的影响。【结果】从蚕沙中筛选出1株高温型细菌，命名为HB-2菌株。根据菌体大小、鞭毛着生位置及数量、16S rDNA核酸序列分析，并结合生理生化特性，HB-2菌株鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。HB-2菌株最佳产酶条件为复合碳源（蚕沙+微晶纤维素+米糠+麸皮）、复合氮源（蛋白胨+酵母膏），产纤维素酶最适反应 pH 6.5，最适温度35 ℃。【结论】HB-2菌株CMCase活性较敏感且产酶量大，具有制成菌剂应用于蚕沙无害化快速腐熟的潜力。

关键词： 蚕沙；纤维素降解菌；短小芽孢杆菌；鉴定；酶活性

中图分类号： Q939.124 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）12-2065-07

Abstract：【Objective】Cellulose-degrading bacteria were isolated from silkworm， in order to provide high-quality strain for harmless quick composting of silkworm excrement. 【Method】Using CMC-Na culture medium， cellulose-degrading bacteria were isolated from silkworm excrement. Then obtained cellulose-degrading bacteria were identified based on its morphology， biochemical characters， 16S rDNA sequence etc. And effects of carbon source， nitrogen source， pH， culture time and culture temperature on cellulase activity of isolated strain were studied. 【Result】Results showed that， a strain of high-temperature resistant bacterium was screened out， which was named HB-2 strain. According to its size， flagella position and number， 16S rDNA sequence and physio-biochemical characteristics， HB-2 strain was identified as Bacillus pumilus. Enzyme-producing conditions of HB-2 strain were as follows： composite carbon sources including silkworm excrement+microcrystalline cellulose+rice bran+wheat bran， composite nitrogen sources including peptone+yeast extract， optimum pH for cellulose producing being 6.5， optimum temperature for cellulose producing being 35 ℃. 【Conclusion】HB-2 strain has sensitive CMCase activity and produces a large amount of cellulase， so which can be made into bactericide， then applied to harmless quick composting of silkworm excrement.

Key words： silkworm excrement； cellulose-degrading bacteria； Bacillus pumilus； identification； enzyme activity

0 引言

【研究意義】蚕沙是蚕排出的粪便、食剩残桑及蚕座垫料的统称（杨海霞等，2002）。近年来，随着我国“东桑西移”工程的推进发展，养蚕集约化程度逐步提高，蚕沙产生量也逐年增加。目前蚕沙的利用率较低，除极少部分被用来提取叶绿素、蛋白质和果胶等外，部分蚕沙堆沤用作肥料（高云超等，2011），但蚕沙富含蛋白质和大量难降解的纤维素，由于纤维素降解速度较慢，致使蚕沙堆肥发酵时间长、肥效低，同时，发酵过程中产生的臭味难以消除而造成空气污染，雨水冲刷又极易造成面源污染（刘鹏等，2014）；此外，未经处理直接丢弃的蚕沙带有的蚕病原菌传播和环境污染问题等严重影响桑蚕产业的可持续发展。因此，筛选和分离高产纤维素酶的功能降解菌种，研究其对蚕沙纤维素的降解能力，对蚕沙的生物无害化处理，实现蚕沙资源化循环利用具有重要意义。【前人研究进展】目前，木质纤维素降解酶的研究与应用主要集中于产酶量大、酶系组成较齐全的菌株（孙宪昀等，2007）。张明珠等（2008）从江苏省泰州市的农田土壤和木材厂腐烂的木材中筛选出白腐真菌、绿色木霉、纤维单胞菌、肋生菌、单胞菌、黑曲菌和节杆菌等7种具有降解纤维材料能力的菌株。王洪媛和范丙全（2010）采用滤纸片孔洞法、滤纸条降解法、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）水解圈测定法、秸秆失重法、纤维素分解率测定法、胞外酶活测定法等常规秸秆纤维素降解菌的筛选方法，筛选获得3株高效秸秆纤维素降解真菌菌株。已有学者利用纤维素降解菌对动物草料青贮、动物饲料、甘蔗渣等的纤维素降解效果进行评价。王贤丰等（2015）从海水中筛选得到2株对甘蔗渣纤维素酶活力较高的纤维素降解菌Z4和S5，两者适宜比例的混合发酵可明显提高对甘蔗渣纤维素的降解能力。黄勤楼等（2016）从引进的多种纤维素降解菌中筛选出酶活力较高的11、21和36号菌株，3株菌株均能改善牧草的青贮品质，且不同程度地降解牧草纤维素。王尧悦等（2016）对课题组前期分离保存的一株纤维素降解菌进行鉴定，并检测其对饲料粗纤维的降解效果，结果表明，分离到的纤维降解菌为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis N3，N3菌株主要分泌分子质量70 ku以上、耐热的纤维素酶，对饲料粗纤维有较强的降解能力。【本研究切入点】目前鲜见蚕沙堆肥中纤维素降解菌的文献报道，仅岑贞陆等（2013a）通过不同的培养基查明广西蚕沙纤维素降解菌群中细菌、放线菌、真菌的分离频率，以及对放射线菌T-1菌株的产酶条件进行了研究，但尚未对分离所得菌株进行鉴定，菌株分类学地位不明确，致使其利用缺乏依据。【拟解决的关键问题】采用浓度梯度稀释法从蚕沙堆肥中分离纤维素降解菌，对分离获得的纤维素降解菌开展分类学鉴定，并测定菌株纤维素酶活性，以期为蚕沙无害化快速腐熟处理提供优质菌种。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料蚕沙采自广西南宁市横县云表镇。

供试培养基：NA培养基（方中达，1998）：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，蔗糖5.0 g，琼脂 17.0 g，蒸馏水1 L， pH 7.0；CMC-Na培养基（王海滨等，2015）：CMC-Na 10.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨2.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，琼脂17.0 g/L，pH 7.0。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 纖维素降解菌的分离及酶活性测定 纤维素降解菌分离参照张楠等（2010）的方法进行。若观察到菌落生长处及周围形成一透明圈，则表明获得目标纤维素降解菌，将目标纤维素降解菌菌株纯化后备用。

对分离所得菌株进行纤维素酶活性测定，其中羧甲基纤维素酶（CMCase）和滤纸酶（FPAase）活性测定参照张楠等（2010）的方法执行。

1. 2. 2 分离菌株形态学观察 分离所得菌株在NA培养基上培养24～36 h后参照文献（方中达，1998）进行革兰氏染色观察，并观察菌落及菌体形态。

1. 2. 3 分离菌株生理生化测定 分离所得菌株采用微量反应管（购自杭州天和微生物试剂有限公司）进行生理生化测定，测试项目有葡萄糖氧化发酵测定、硝酸盐还原反应、反硝化、甲基红（M.R.）、H2S、牛奶分解、明胶液化、接触酶反应、氧化酶反应、Tween-80、柠檬酸盐的利用、吲哚试验等12项指标，结果参照《伯杰细菌鉴定手册》（Buchanan and Gibbons，1984）和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）进行分析。

1. 2. 4 16S rDNA基因序列测定及系统发育进化树构建

1. 2. 4. 1 DNA提取 采用煮沸法（岑贞陆等，2013b）提取测试菌株的基因组DNA：挑取一环新鲜菌苔（NA培养基上30 ℃培养24 h）于0.5 mL无菌水中振荡混匀；于100 ℃沸水中煮5 min，迅速置于冰水混合物中冰浴10 min后120 r/min 离心8 min，取上清液作为模板DNA，-20 ℃保存，用于PCR扩增。

1. 2. 4. 2 菌株DNA的PCR扩增 PCR扩增采用16S rDNA细菌通用引物，正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3'，反向引物：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。PCR反应体系25.0 μL，包括10× Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.0 μL， E×Taq enzyme（5 U/μL）0.2 μL，正向引物（10 pmoL）1.0 μL，反向引物（10 pmoL）1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 18.3 μL，以ddH2O为模板作阴性对照。扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统仪进行观察及拍照，并送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

1. 2. 4. 3 系统发育进化树构建 核苷酸序列利用Clustal X 1.81进行联配，联配结果用BIOEDIT编辑，利用MEGA 4.0构建由核苷酸序列生成的系统发育进化树，参数利用Neighbour-Joining，通过1000次Bootstrap抽样及最大似然组成模型。

1. 2. 5 分离菌株产酶条件

1. 2. 5. 1 不同碳源对分离菌株产酶的影响 去除碳源后的发酵培养基分别加入5%碳源（蚕沙、米糠、微晶纤维素、蚕沙+米糠、麸皮、微晶纤维素+米糠、蚕沙+麸皮、米糠+麸皮、微晶纤维素+麸皮、蚕沙+微晶纤维素+米糠+麸皮），接种分离菌株培养，分别测定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 2 不同氮源对分离菌株产酶的影响 去除氮源后的发酵培养基分别加入4%氮源[KNO3、（NH4）2SO4、NH4CL、尿素、蛋白胨、酵母膏、尿素+酵母膏、尿素+蛋白胨、酵母膏+蛋白胨]，接种分离菌株后培养，分别测定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 3 不同pH对分离菌株产酶的影响 分别将发酵培养基的pH调为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，接种分离菌株培养7 d后，分别测定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 4 不同温度对分离菌株产酶的影响 发酵培养基接种分离菌株后分别置于不同温度（30、35、40、45、50和55 ℃）下培养，然后分别测定CMCase和FPAase活性。

1. 2. 5. 5 不同培养时间对分离菌株产酶的影响 发酵培养基接种分离菌株后连续培养10 d，每天测定CMCase和FPAas活性。

2 结果与分析

2. 1 目标纤维素降解菌的分离及其酶活测定结果

从样品中筛选出1株高温型细菌，命名为HB-2菌株。HB-2菌株菌落直径3.18 mm，水解圈半径8.26 mm（图1），水解圈半径与菌落直径的比值为2.60， CMCase和FPAase活性分别为3.32和0.70 U。

2. 2 HB-2菌株形态学观察结果

HB-2菌株单菌落呈不规则状，表面褶皱凸起，边缘多枝，菌落黄色，不透明，无粘性，无可溶性色素产生，无运动性，革兰氏染色阳性，有芽孢（图2）。在透射电镜下观察，菌体呈杆状，两端圆钝，菌体大小约1.0 μm×2.4 μm，颜色较深，鞭毛周生（图3）。

2. 3 HB-2菌株生理生化测定结果

测定结果（表1）显示，HB-2菌株生理生化反应为阳性的项目有：氧化酶、接触酶、柠檬酸盐利用、H2S、明胶液化、牛奶分解和Tween-80；生理生化反应为阴性的项目有：葡萄糖氧化发酵、M.R.、硝酸盐还原、吲哚试验和反硝化。

2. 4 HB-2菌株系统发育进化树构建及同源性分析

经过引物对HB-2菌种进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条约1500 bp条带（图4），经测序后得到的16S rDNA序列提交至www.ncbi.nlm.nlh.gov，BLAST比对结果表明，HB-2菌株与IHBB9209、NE16、MB-P8等Bacillus pumilus菌株的序列相似性在99.%以上。采用MEGA 4.0分析，结果发现HB-2菌株与登录号为KR085783.1、KR868768.1、KP235238.1、HM022734.1等B. pumilus聚成一簇（图5），与同属的其他种存在明显的遗传距离。结合形态学特征及生理生化性状，可将HB-2菌株鉴定为短小芽孢杆菌（B. pumilus）。

2. 5 HB-2菌株产酶条件

2. 5. 1 碳源对HB-2菌株产酶的影响 由表2可看出，碳源对HB-2菌株产酶能力有不同程度的影响。HB-2菌株对复合碳源的利用明显强于单一碳源，可溶性碳源和不溶性碳源组成的复合碳源能更有效地诱导该菌产生纤维素酶，其中以蚕沙+微晶纤维素+米糠+麸皮为碳源时CMCase和FPAase的活性最高，分别为17.8和3.4 U。

2. 5. 2 氮源对HB-2菌株产酶的影响 表3结果显示，KNO3、NH4CL、（NH4）2SO4和尿素等无机氮源对诱导HB-2菌株产CMCase和FPAase能力均较弱。蛋白胨、酵母膏、蛋白胨+酵母膏等有机氮源有利于诱导HB-2菌株产CMCase，其中以蛋白胨+酵母膏为复合有机氮源的处理区产CMCase最高（16.4 U）；HB-2菌株对供试氮源产FPAase不敏感，所有处理区的酶活性不超过3.7 U（表3）。

2. 5. 3 pH对HB-2菌株产酶的影响 由图6可知，HB-2菌株在pH 4.0～10.0均可产酶，随着pH升高，FPAase活性随之增加，但增幅很窄，在供试pH内FPAase活性不超过2.0 U；而CMCase活性对pH较敏感，当pH为5.5时酶活开始陡升，当pH为6.5时CMCase活性达到峰值（8.0 U），此后下降。

2. 5. 4 温度对HB-2菌株产酶的影响 由图7可知，HB-2菌株在30～55 ℃时均可产酶，但CMCase活性比FPAase活性变幅大，FPAase活性变幅较平缓，表明CMCase比FPAase对温度更敏感。当温度为35 ℃时CMCase活性达峰值（7.0 U），此后酶活随温度升高而降低，酶活性曲线变陡降值明显；当温度为50 ℃以后，CMCase活性趋于平稳，不超过4.0 U。FPAase对温度不敏感，酶活性变幅平缓，供试温度内不超过2.0 U。

2. 5. 5 培养时间对HB-2菌株产酶的影响 由图8可知，接种HB-2菌株第2 d后 FPAase活性略有降低，第4 d后开始略微升高，但增值非常缓慢，直至第8 d才达到最高值（2.0 U）；接种后第1～6 d CMCase活性缓慢增加，第6 d后增值明显，第8 d达最高值（7.0 U）。

3 讨论

本研究根据菌体大小、鞭毛着生位置及数量、16S rDNA核酸序列分析，并结合生理生化指标对HB-2菌株进行鉴定，发现HB-2 菌株属短小芽孢杆菌（B. pumilus）。B. pumilus是芽孢杆菌属的一种，在自然界普遍存在，在水样、土样、禽畜粪便、动物、植物（张立静等，2011；霍培元等，2012；韦露等，2015）等各种环境中均可分离获得。该菌有的可产生抗菌素及抗菌蛋白等拮抗物质，抑菌范围广，对动植物多种病原菌具有抑制作用（王静等，2010），有的可作为微生物饲料添加剂（徐鹏等，2012），有的能产生抗肿瘤多糖（梁静娟等，2006），有的可降解苯并[a]芘（朱婷婷和倪晋仁，2012）。本研究明确了HB-2菌株能降解蚕沙纤维素，有利于丰富人们对B. pumilus生物学多样性的认识。

石美宁等（2012）利用酵素菌、刘鹏等（2014）通过草酸青霉菌、宾荣佩等（2015）采用多种复合菌剂应用于蚕沙堆肥促进腐熟研究，但上述研究者均以外源菌剂微生物途径对蚕沙进行堆肥促腐，而本研究探讨内源菌株（蚕沙土著微生物纤维素降解菌B. pumilus）的酶活性及其降解特性，這方面的研究国内鲜有报道。 无论是外源菌剂还是内源菌株，目前蚕沙的微生物降解可供选择的菌种谱仍明显狭窄。蚕沙中微生物体系相当复杂，目前尚未发现蚕沙菌群结构及其时空分布的文献，除从样本分离获得HB-2菌株外，还有其他细菌和放射线菌（岑贞陆等，2013a），由于可供参考的资料和基因库信息极为有限，更多的蚕沙土著微生物的鉴定工作尚待开展，对于HB-2菌株在蚕沙堆肥降解纤维素的机制及其遗传调控基础等问题也有待进一步深入研究。

4 结论

功能性纤维素降解菌HB-2菌株有芽孢且适宜生长的温度及pH均较广，具有较高的抗逆性和适应力，方便储存和运输；HB-2菌株CMCase酶活较敏感且产酶量大，具有制成菌剂应用于蚕沙无害化快速腐熟的应用潜力。

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（责任编辑 麻小燕）