饵料中添加镉对罗非鱼组织形态的影响

罗永巨 钟欢 周毅 单丹 郭忠宝 黄一帆 邹源 徐跑

摘要：【目的】探讨摄入镉在罗非鱼中的累积效应及其对肠道、肾脏和肝脏组织的影响，为罗非鱼及其他水产品种的养殖及质量安全控制提供理论依据。【方法】在罗非鱼饵料中分别添加0、50、100和200 mg/kg的氯化镉，按鱼体重3.0%～3.5%的量投喂2月龄健康吉富罗非鱼，饲养60 d后测定罗非鱼肠道、肾脏和肝脏组织中的镉含量，并取样制作石蜡切片观察组织形态结构的变化。【结果】至试验结束时，各处理组间的罗非鱼全长、体长、体高等指标无显著差异（P>0.05），但其肠道、肾脏和肝脏组织中镉含量均随食物相镉添加量的增加而升高，且存在明显的剂量—效应关系。投喂含镉饵料可引起罗非鱼肠道、肾脏和肝脏组织形态结构发生病理变化，具体表现为肠绒毛排列紊乱、上皮细胞出现明显的空泡变性；肾小管排列结构紊乱程度加重、肾小球出现轻度萎缩甚至坏死；肝窦增宽、结构紊乱，少数肝细胞核浓缩变小甚至溶解，肝细胞界限模糊不清。【结论】食物相镉对罗非鱼生长的影响是通过富集于肠道、肝脏和肾脏等组织中，并引起这些组织细胞凋亡及破坏关键组织形态结构来实现。

关键词： 罗非鱼；镉；富集；肠道；肾脏；肝脏；组织形态

中图分类号： S965.125 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1228-06

0 引言

【研究意义】随着我国工业的快速发展，环境中重金属污染问题日益严重。重金属毒性较大，且能够长期富集于生物体内，已成为最严重的环境污染物之一（任继平等，2003），其中镉（Cd）由于毒性强、环境持久性长及易被生物体累积等特点（沈雪婷等，2014；邢丹等，2016）而受到广泛关注。在联合国环境规划署提出的12种具有全球性意义的危险化学物质中，镉被列为首位（成喜雨等，2015）。因此，研究镉元素在生物体内的迁移及富集情况对评估镉污染风险具有重要意义。【前人研究进展】目前，农业和工业活动排放的三废是环境污染物镉的主要来源（任继平等，2003），并通过不同途径（表面吸附、水相及食物相等）富集于植物或动物体内，进入食物链，最终影响人类健康（黄秋婵等，2007）。鱼类是水生动物的重要成员，对水环境中的镉污染物非常敏感。当水体中的镉浓度过高时，可造成鱼类生理活动紊乱、行为异常及组织细胞病变等（尚晓迪和何志强，2009）。另外，镉对鱼类的内分泌系统、免疫系統及生殖系统均能造成不良影响（苏傳福，2005）。张玉平等（2008）研究表明，高浓度和长时间的镉胁迫能抑制大弹涂鱼肝脏超氧化物歧化酶活性，致使其机体出现中毒症状。胡蓉等（2011）研究表明，鲫鱼红细胞对镉的最大耐受力为1.5 mg/L胁迫24 h或0.4 mg/L胁迫48 h。可见，研究重金属镉对鱼类组织形态的影响，不仅能阐明镉对鱼类的毒理学效应，还可为评估镉污染风险提供参考依据。对水生生物来说，水相及食物相是重金属累积的重要途径，传统的暴露试验只考虑水相而忽略了食物相的贡献，但近年来的研究表明，食物相可能是许多水生生物体内重金属累积的主要途径（王文雄和潘进芬，2004）。【本研究切入点】罗非鱼是世界性养殖鱼类，是联合国粮农组织（FAO）向全世界推广养殖的主要对象，同时被我国农业部定为优先发展的淡水养殖优势品种。我国罗非鱼产量目前稳居世界第一，占全世界总产量的40%以上，但至今有关镉对罗非鱼组织形态影响的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过测定罗非鱼组织器官中的镉含量，探讨摄入镉在罗非鱼中的累积效应及其对肠道、肾脏和肝脏组织的影响，以期为罗非鱼及其他水产品种的养殖及质量安全控制提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

2014年6月从广西水产科学研究院罗非鱼遗传育种中心挑选2月龄的健康吉富罗非鱼（体重58.80±13.84 g），在1500 L的聚乙烯塑料桶中暂养15 d，以适应实验室环境。基础饵料配方：20%鱼粉、25%豆粉、20%玉米粉、30%次粉、3%维生素和矿物质预混料、0.5%羧甲基纤维素。维生素和矿物质预混料配方：维生素A 22.0万U/kg、维生素D3 11.0万U/kg、维生素E 1500 U/kg、维生素K 0.8 g/kg、维生素B1 1.1 g/kg、维生素B2 2.2 g/kg、维生素B6 2.0 g/kg、维生素H 15.0 mg/kg、维生素B12 4.0 mg/kg、维生素C 3.0 g/kg、铁元素160.0 mg/kg、镁元素344.0 mg/kg、铜元素21.6 mg/kg、锌元素21.6 mg/kg、硒元素25.0 mg/kg和钴元素2.38 mg/kg。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 试验设计 试验共配制3个镉浓度梯度饵料，即在基础饵料中分别添加50、100和200 mg/kg的氯化镉；对照组饵料未添加氯化镉。用喷壶将不同浓度的镉溶液均匀喷洒在基础饵料上，直至喷完，然后置于薄膜上自然风干。试验前测得对照组和3个试验组（I～III）饵料中的镉含量分别为1.43、39.88、78.63和161.15 mg/kg。

1. 2. 2 饲养管理 每处理组110尾罗非鱼，每组3个重复。整个试验周期60 d，每天投喂3次饵料，投喂量为鱼体重的3.0%～3.5%。每次投喂结束后，及时用吸污工具把残余饵料及粪便等清理干净；在饲养期间，每2 d换水1次，养殖用水为曝气后的自来水。养殖水温25.0～27.0 ℃、pH 7.1～7.6、溶氧量6.2～8.9 mg/L、氨氮含量1.41±0.21 mg/L、亚硝酸盐氮0.065±0.016 mg/L、总硬度（以CaCO3计）90.03±2.18 mg/L。

1. 2. 3 生长指标测定 所有罗非鱼在试验结束时均测量全长、体长和体高，并统计各处理组罗非鱼的存活率和肝体比（肝脏重量/体重）。

1. 2. 4 组织中镉含量测定 试验结束后，分别对每处理组罗非鱼（6尾雌鱼、6尾雄鱼）的肠道、肾脏和肝脏进行取材，然后以ICP-MS进行镉含量测定。具体步骤：称取1.0 mg样本置于塑料离心管中，加入1.0 mL硝酸，过夜硝化浸泡；待样本溶解后转入刻度石英管中，并用水冲洗干净，重新加入1.0 mL硝酸；放入石墨消解仪中低温消解至溶液清亮，取出冷却后加双蒸馏水定容至10.0 mL；摇匀，静置过夜，采用电感耦合等离子体质谱仪对样品中的镉含量进行测定。

1. 2. 5 组织学切片及观察 取罗非鱼的肠道、肾脏和肝脏组织，经Bouins液固定24 h后放入70%酒精中。梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，莱卡切片机切片（厚度7 μm）。将干燥后的切片经二甲苯脱蜡后梯度复水，再进行苏木精—伊红染色、二甲苯透明、树脂封片。组织石蜡切片采用莱卡光学显微镜观察并用显微照相系统拍照。

2 结果与分析

2. 1 食物相镉对罗非鱼生长的影响

整个试验过程中，仅试验组II和试验组III出现罗非鱼死亡现象，死亡率均为1.8%。投喂含镉饵料对罗非鱼生长的影响不明显，饲养60 d后各处理组间的罗非鱼全长、体长、体高等指标（表1）无显著差异（P>0.05，下同），但试验组I雌、雄性罗非鱼的肝体比显著高于其他处理组（P<0.05，下同），分别为（1.93±0.56）%和（1.77±0.38）%。

2. 2 镉在罗非鱼各组织中的富集情况

由图1可以看出，试验组II和试验组III罗非鱼肠道组织中的镉含量较对照组有显著升高，试验组I罗非鱼肠道组织中的镉含量也高于对照组，但差异不显著。投喂含镉饵料60 d后，罗非鱼肾脏组织中的镉含量均显著高于对照组，其中以试验组III罗非鱼肾脏组织中的镉含量最高，达91.24±30.34 μg/g。镉在肝脏组织中的富集情况与其在肾脏组织中的富集情况一致，均存在明显的剂量—效应关系，3个试验组的罗非鱼肝脏组织中的镉含量均显著高于对照组，也是以试验组III罗非鱼肝脏组织中的镉含量最高，达58.90±17.00 μg/g。

2. 3 镉对罗非鱼组织形态结构的影响

投喂60 d含镉饵料后，罗非鱼的肠绒毛排列紊乱，尤其是试验组II和试验组III更明显，上皮细胞出现明显的空泡变性（图2）。随着镉添加量的增加，罗非鱼的肾小管排列结构紊乱程度加重，肾小球出现轻度萎缩，甚至有坏死现象（图3）。罗非鱼肝脏组织形态结构受投喂含镉饵料的影响较明显，随着镉添加量的增加，亦出现肝窦增宽、结构紊乱的病变；此外，有少数肝细胞核浓缩变小，甚至溶解，肝细胞界限模糊不清（图4）。

3 讨论

镉是动物机体生长发育过程中的非必需元素，长期在机体内残留对其正常生理活动会有明显影响。丁磊等（2005）研究了不同镉浓度添加饵料对鲫鱼增重率的影响，结果显示，低浓度组（3、18和108 mg/kg）的鲫鱼增重率明显上升，而高浓度组（648 mg/kg）的增重率明显下降。在不同物种中，镉对其生长发育的影响作用也有所不同，即使是同一物种，不同镉浓度对其生长发育造成的影响也存在明显差异。本研究结果表明，食物相镉暴露对罗非鱼生长无明显影响，但试验组I（39.88 mg/kg）罗非鱼的肝体比呈显著上升，提示投喂含镉饵料后有可能对肝脏产生毒理作用。肝脏是镉的主要富集部位，因此镉暴露对肝脏损伤较大，即罗非鱼肝脏在39.88 mg/kg镉含量组暴露60 d后有明显的损伤症状；而在高浓度组（78.63和161.15 mg/kg）未出现肝脏肿大，可能与内分泌、抗氧化、免疫等系统的反馈抑制调节机制有关，但具体原因有待进一步探究。

重金属主要通过两种方式进入鱼体：第一，水体中的重金属可通过鳃呼吸进入血液循环系统，最终被转移到其他组织；第二，饵料中的重金属由肠道吸收，最终转移到其他组织。鱼鳃及肠道是两个主要的重金属吸收部位。由于水体中的重金属通常与急性毒性有关，因此水中重金属通过鳃吸收的研究已广泛开展。近年来，食物相重金属吸收也日益受到重视，并认为食物中的重金属是其富集于鱼体内的主要途径（Castro-González and Méndez-Armenta，2008）。本研究结果表明，食物相镉暴露之后，罗非鱼的肠道、肝脏、肾脏组织中均有镉累积，积累量排序为肾脏>肠道>肝脏，由此可看出镉在鱼体组织间的流动性。肠道是消化食物的直接组织，即饵料中镉最先残留在肠道组织。肾脏和肝脏组织作为重要的解毒和代谢器官，镉的存贮对其行使功能有重大影响。因此，在后续研究中应探析影响不同组织富集镉的关键因子，进而揭示镉对这些组织器官的毒害作用。

本研究结果表明，在镉暴露后，罗非鱼肠绒毛排列不规则，杯状细胞数量增加，且出现水肿现象。小肠绒毛是肠道内部行使消化吸收功能的重要场所，其长度和隱窩性状是影响营养物质消化吸收的关键因素，镉可引起小肠绒毛受损，进而导致肠道消化吸收能力下降（Berntssen et al.，2001）。肾脏是重要的排泄、分泌、代谢和免疫器官，其损伤可引发多种并发症，导致机体生理活动失调。在哺乳动物中，镉中毒会损害肾脏，而肾脏损伤可进一步导致睾丸损伤、心脏病死亡率增加及高血压等并发症（Saboli et al.，2010）。在硬骨鱼中，镉暴露可导致其肾小管出现粉色颗粒状，并出现细胞核碎片化等其他退行性特征（Annabiet al.，2011）。镉对肾脏组织形态结构的影响主要集中在对肾小管的破坏，且镉富集量与损伤程度呈正相关。本研究结果表明，在镉损伤的罗非鱼中，肾小管排列结构紊乱程度加重，肾小管出现上皮细胞变性、坏死现象。

急性暴露导致镉积累主要在肝脏组织（Thophon et al.，2003），因此肝脏是受镉急性中毒的靶器官。急性镉中毒的肝脏组织形态结构主要表现为肝细胞肿胀、脂肪累积增多及大规模肝细胞坏死。此外，镉中毒可导致肝脏线粒体肿胀及粗面内质网囊泡破坏（Li et al.，2003）。本研究结果表明，在镉暴露后肝脏细胞出现空泡变性、部分肝细胞核浓缩变小甚至溶解，同时出现肝窦增宽、结构紊乱等现象，充分证明了镉对肝脏的毒性作用。虽然镉对罗非鱼肝体比的影响并不明显，但肝脏细胞水平已明显被破坏，其差异原因有待进一步研究。

4 结论

食物相镉对罗非鱼生长的影响是通过富集于肠道、肝脏和肾脏等组织中，并引起这些组织细胞凋亡及破坏关键组织形态结构来实现。

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（責任編辑 兰宗宝）