禾花鲤鱼种暴发性死亡征病原菌的分离鉴定及药敏试验

龙苏 邓小红 梁静真 牛志伟 韩书煜 范华龙 黄钧

摘要：【目的】明确引起禾花鲤发生暴发性死亡征的病原菌及其耐药性，为有效防控禾花鲤暴发性死亡征提供科学依据。【方法】采用常规方法分离病原菌，以API 20NE生化鉴定与16S rRNA基因序列分析相结合的方法进行鉴定，人工回归感染试验确定分离菌株的致病性，K-B纸片扩散法测定病原菌对药物的敏感性。【结果】从广西全州县患暴发性死亡征禾花鲤的肝脏中分离获得1株优势菌株（TH5），API 20NE生化鉴定和16S rRNA基因序列分析结果显示，分离菌株TH5为简达气单胞菌（Aeromonas jandaei），与简达气单胞菌标准菌株ATCC 49568（NR 119040）和CDC 0787-80（NR 037013）的相似度分别为99.9%和99.6%。人工回归感染试验结果表明，菌株TH5是导致禾花鲤暴发性死亡征的病原菌。该菌株对复方新诺明、环丙沙星、多粘菌素B等11种药物高度敏感，对青霉素G、复达欣、先锋霉素VI等8种药物已产生耐药性。【结论】引起广西全州县养殖禾花鲤暴发性死亡征的病原菌是简达气单胞菌，生产中可选用复方新诺明、环丙沙星、多粘菌素B等药物进行防治。

关键词： 禾花鲤；简达气单胞菌；分离鉴定；药敏试验

中图分类号： S965.116.42 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1241-06

0 引言

【研究意義】禾花鲤（Procypris merus）是鲤鱼（Cyprinus carpio）的变种，原产于广西北部，体短而肥，全身紫褐色，细叶鳞，皮薄，内脏隐约可见，因其在稻田中被长期驯化养殖和摄食水稻禾花而得名。禾花鲤可食率高，高蛋白低脂肪，且富含多种人体必需氨基酸（杨四秀和蒋艾青，2009），是广西全州县重要的特色水产养殖品种，也是桂林市十大名牌农产品之一，广受消费者青睐。近年来，禾花鲤稻田养殖规模越来越大，呈逐年增长趋势，其养殖区域主要集中在桂北地区的灌阳县、全州县、兴安县和桂中地区的融安县、三江县等地，因此，确保禾花鲤养殖业的健康发展对促进地方农业经济发展及加速新农村建设均具有重要意义。【前人研究进展】细菌性疾病是鲤鱼养殖过程中的常见病害，主要有嗜水气单胞菌病（王泽洲等，1997）、出血病（韩英等，2005）、细菌性败血症（张玉芬等，2011）、竖鳞病（于翔，2011）、肺炎克雷伯氏菌病（卢玉婷等，2014）和杀鲑气单胞菌病（王海娟和王利，2015）等。此外，龚倩等（2010）从患病框镜鲤中分离出致病性维氏气单胞菌，温贵兰等（2012）从患病瓯江彩鲤中分离出简达气单胞菌，韩娜娜等（2013）和沈晓静等（2014）分别从患病锦鲤中分离出摩氏摩根氏菌病和荧光假单胞菌病。近年来，有关禾花鲤的研究主要集中在养殖模式探讨，如莫玉军（2003）、唐春（2004）和黄德文（2009）分别进行了禾花鲤的稻田养殖、池塘养殖和池塘精养技术探索，但鲜见针对禾花鲤病害及其防治的研究报道。【本研究切入点】2014年6月广西全州县某禾花鲤养殖示范基地的禾花鲤发生暴发性死亡，但因缺乏可供参考的防治措施及用药依据，导致大量死亡，经济损失严重。【拟解决的关键问题】对引起该养殖示范基地禾花鲤暴发性死亡征的病原菌进行分离鉴定，并进行药物敏感性试验，旨在明确引起禾花鲤发生暴发性死亡征的病原菌及其耐药性，为有效防控禾花鲤暴发性死亡征提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 病原菌分离与纯化

病样于2014年6月13日采自广西全州县某禾花鲤养殖示范基地，为发病濒死的禾花鲤。病鱼个体重10～15 g，主要症状为体表发红，眼球突出，肛门发红，腹部膨大。剖检发现，病鱼体腔内有大量淡红色腹水，肠道发红，肝胰脏肿大。无菌条件下从病鱼的肝脏、肾脏等器官取样，分别划线接种于普通营养琼脂培养基和兔血琼脂培养基（均购自郑州安图生物工程股份有限公司）上，36 ℃培养18～24 h，挑取菌落形态一致的优势菌株经纯化后转接到斜面培养基，4 ℃保存备用。

1. 2 细菌鉴定

1. 2. 1 生化鉴定 分离菌株的氧化酶试验结果呈阳性，故选用法国梅里埃公司生产的API 20NE生化鉴定试剂条按说明进行细菌生化鉴定。

1. 2. 2 分子鉴定 按刘杰等（2015）的方法收集菌体，提取细菌基因组DNA后-20 ℃保存备用。16S rRNA基因扩增采用由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的细菌通用引物，正、反向引物分别为fD1：（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和rp2（5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）。反应体系25.0 μL：10×PCR缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，25 mmol/L MgC12 2.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U）0.3 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，进行29个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后以1.5%琼脂糖凝胶电泳（100 V，35 min）进行鉴定，用凝膠成像系统观察，并根据出现的电泳条带记录结果。PCR产物送至华大生物技术有限公司进行序列测定。

1. 3 分离菌株致病性测定

用于人工回归感染试验的禾花鲤购于普通市场，平均体重35.1 g。经过20 d的暂养后随机抽取5尾进行剖检观察，并取其肝脏、脾脏、肾脏、脑组织进行细菌接种，确认鱼体健康无病、无细菌感染后用于人工回归感染。按常规方法将分离菌株进行扩大培养后以无菌生理盐水洗下菌落并制成菌悬液，以WGZ-2-XJ细菌浊度仪调整菌悬液的细菌浓度。第1次感染试验时将健康禾花鲤随机分成试验组和对照组，每组30尾，采取胸鳍基部注射感染，其中试验组每尾注射0.2 mL菌悬液，对照组注射相同剂量的无菌生理盐水。注射后，于同样环境下按组分开饲养，连续观察15 d，记录受试鱼的发病症状及死亡情况。取第1次感染试验中发病症状与自然发病症状相似的濒死个体，再进行细菌分离与纯化，按第1次人工感染试验的方法进行第2次人工感染试验。

1. 4 药敏试验

试验用药敏片共28种，除氟苯尼考、磺胺二甲嘧啶、盐酸沙拉沙星、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶和复方磺胺嘧啶6种由广西水生動物病害诊断实验室按于进勋等（2000）的方法自行制备外，其余22种购自杭州天和微生物试剂有限公司。药敏试验采用K-B纸片扩散法，其结果按美国NCCLS 2000的标准进行判定。

2 结果与分析

2. 1 分离菌株的形态及培养特性

从发病濒死禾花鲤的肝脏中分离获得1株优势菌株，编号为TH5。该菌株为革兰氏阴性短杆菌，微溶血。菌落圆形，边缘光滑，中央凸起，呈肉色、灰白色或略带淡桃红色光泽。菌体两端钝圆，多数单个排列，无芽孢，无荚膜。

2. 2 细菌鉴定结果

2. 2. 1 生化鉴定结果 根据API 20NE生化鉴定结果（表1），可确定菌株TH5的API阳性代码值为7176755，

初步鉴定为简达气单胞菌（Aeromonas jandaei）。

2. 2. 2 分子鑒定结果 PCR扩增得到分离菌株TH5的16S rRNA基因片段，大小为1410 bp（图1），与预期结果一致。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶回收提纯后进行测序，将测序结果与GenBank中的16S rRNA基因序列进行同源性比对，以Clustal X进行多重序列比对分析，并用MEGA 6.1构建系统发育进化树（图2）。根据构建的系统发育进化树和比对分析结果可知，分离菌株TH5（GenBank登录号KU143916）与简达气单胞菌标准菌株ATCC 49568（NR 119040）和CDC 0787-80（NR 037013）同聚一簇，其相似度分别为99.9%和99.6%。

2. 3 分离菌株的人工回归感染试验结果

经人工注射感染后，试验组禾花鲤出现鳃丝末端溶解，体表发白且有大量黏液，腹部肿胀，肛门发红，剖检发现其肝脏肿大（部分病鱼肝脏糜烂），体腔有腹水，胆囊肿大，脾脏肿大等症状。经取样接种，可分离获得与菌株TH5一致的菌株。对照组禾花鲤摄食、活动基本正常，未出现死鱼现象。由表2可以看出，菌株TH5对禾花鲤有较强的致病性，可引起禾花鲤大量死亡，两次人工回归感染试验的平均死亡率达48.33%，表明分离菌株TH5是引起禾花鲤暴发性死亡征的病原菌。

2. 4 药敏试验结果

药敏试验结果（表3）表明，菌株TH5对复方新诺明、环丙沙星、多粘菌素B、左氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、多西环素、氟苯尼考、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶和复方磺胺嘧啶高度敏感，对青霉素G、复达欣、先锋霉素VI、菌必治、新霉素、新生霉素、先锋必和盐酸沙拉沙星已产生耐药性。

3 讨论

目前，关于鲤鱼细菌性疾病已有大量报道，其病原菌主要有嗜水气单胞菌（A. hydrophila）（王泽洲等，1997；张玉芬等，2011）、温和气单胞菌（A. sobria）（韩英等，2005）、豚鼠气单胞菌（A. caviae）（韩英等，2005）、维氏气单胞菌（A. veronii）（龚倩等，2010）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）（于翔，2011；沈晓静等，2014；周阳等，2015）、鲶爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）（于翔，2011）、摩氏摩根氏菌（Morganella morganii）（韩娜娜等，2013）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）（卢玉婷等，2014）和杀鲑气单胞菌（A. salmonicida）（王海娟和王利，2015）等。本研究从患暴发性死亡征禾花鲤鱼病样中分离获得的病原菌为简达气单胞菌，与温贵兰等（2012）从彩鲤中分离获得的病原菌种类相同。可见，引起鲤鱼病害的病原菌种类呈多样性，除了淡水养殖中常见的嗜水气单胞菌和温和气单胞菌外，近年来又分离出多种新的病原菌，给禾花鲤细菌性疾病的诊治带来极大困难。

简达气单胞菌隶属于气单胞菌属（Aeromonas），在《伯杰细菌鉴定手册》（1984年版）中被称为温和气单胞菌。Carnahan等于1991年确定了简达气单胞菌的分类地位。简达气单胞菌可引起人类腹泻（王晓萍等，1997）和水牛猝死症（方福明等，2008），近年来发现该菌在淡水鱼养殖池塘中也有分布（王一娟，2010），可感染引起养殖鱼类发病死亡（温贵兰等，2012；杨宁等，2015），表明简达气单胞菌是一种人—畜—鱼共患的病原菌。本研究以×108 CFU/mL的简达气单胞菌悬液对健康禾花鲤进行人工感染试验，其平均致死率为48.33%，明显低于该菌对罗非鱼的致病力（杨宁等，2015）。另外，本研究中简达气单胞菌的溶血性与从瓯江彩鲤中分离到的菌株（温贵兰等，2012）也不同。从禾花鲤和瓯江彩鲤中分离获得的简达气单胞菌在溶血性和致病力方面存在明显差异，其是否与菌株所携带的毒力基因有关尚待进一步探究。

本研究的药敏试验结果表明，菌株TH5对复方新诺明、环丙沙星、多粘菌素B等11种药物高度敏感，对青霉素G、复达欣、先锋霉素VI等8种药物已产生耐药性。这与从瓯江彩鲤中分离获得的菌株HX201006-2（温贵兰等，2012）、罗非鱼上分离获得的菌株NL05（杨宁等，2015）均不相同，究其原因可能与不同养殖户的用药习惯有关。致病性嗜水气单胞菌和温和气单胞菌连续低浓度接触某种药物时可对该药物产生很强的耐药性（黄钧等，2013；黄新财等，2013）。因此，在生产用药过程中应避免经常使用同一类药物，且要做到科学精准用药，避免因乱用和滥用药物而导致病原菌产生耐药性。

4 结论

引起广西全州县养殖禾花鲤暴发性死亡征的病原菌是简达气单胞菌，生产中可选用复方新诺明、环丙沙星、多粘菌素B等药物进行防治。

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（责任编辑 兰宗宝）