新型反相/强阴离子交换混合模式材料用于磷酸化肽富集

董立君+张丽媛+彭金咏+董佩佩+王丽莉+张利娟+候晓林+赵艳艳

摘 要 建立了新型反相/强阴离子交换混合模式材料（C 18/SAX）的磷酸化肽富集方法。考察了流动相组成（乙腈浓度、甲酸浓度、缓冲盐浓度）对酪蛋白（α.Casein）酶解液中磷酸化肽分离选择性的影响。实验结果表明， 磷酸化肽在C 18/SAX上的保留行为受疏水和离子交换作用力的共同调控， 单磷酸化肽先于多磷酸化肽从材料上洗脱出来。随着甲酸浓度增加， 磷酸化肽的保留减弱；随着盐浓度增加， 磷酸化肽保留变小。采用优化后的流动相， 建立以20% ACN/20 mmol/L NH4Ac作为上样溶液， 20% ACN/0.1% FA和50% ACN/100 mmol/L NH4Ac/2% FA分别作为洗脱液分段洗脱单、多磷酸化肽的方法。以α.Casein和人血清白蛋白（HSA）酶解液的混合溶液（1∶20， n/n）作为模拟样品， 实现了单、多磷酸化肽的同时富集和分段洗脱， 分别检测到4条单磷酸化肽和14条多磷酸化肽的信号。将本方法用于牛奶中的磷酸化肽检测， 共鉴定到4条单磷酸化肽和8条多磷酸化肽信号。结果表明， 本富集方法选择性高， 有良好的应用前景。

关键词 磷酸化肽； 反相/强阴离子交换材料； 富集

1 引 言

磷酸化修饰是重要的蛋白质翻译后修饰方式。蛋白质的磷酸化能够调控细胞的增殖、发育、分化和信号转导等重要的生命进程[1]， 具有重要的生物学意义。然而， 在通常的质谱分析中， 磷酸化肽的信号会被其它高丰度的非磷酸化肽所抑制， 导致磷酸化肽难以分离鉴定[2，3]。因此有必要选择性地富集磷酸化肽[4]。目前， 富集磷酸化肽的材料主要有固定金属螯合色谱（IMAC）材料[5～7]、氧化钛（TiO2）[8～10]、离子交换色谱（IXC）材料[11]、亲水作用色谱材料[12]等。强阴离子交换色谱（SAX）在磷酸化肽选择性富集中效果显著。然而， SAX在富集磷酸化肽时， 带有相同电荷的肽会被同时洗脱；另外， 单磷酸化肽信号会抑制多磷酸化肽的信号。因此， 发展能兼顾单、多磷酸化肽选择性富集的材料非常重要。

反相/强阴离子交换材料（C 18/SAX）是一种能够同时提供疏水和强阴离子交换作用的新型色谱材料， 采用极性共聚的合成方法将十八烷基键合相和季铵碱按照一定可调控比例键合到硅胶表面[13]。研究表明， 此材料对于极性不强的阴离子小分子（例如马兜铃酸）具有较强的保留[13]， 但尚未有用于磷酸化肽的选择性富集的报道。就结构特点而言， 磷酸化肽在一定pH条件下也以阴离子形式存在， 但其分子量相对较大， 在C 18/SAX上的保留机制应该与小分子有一定差异， 因此有必要考察C 18/SAX对磷酸化肽的富集效果以及保留机制。

本研究以标准蛋白α.Casein酶解物作为模拟样品， 考察不同流动相条件（乙腈含量、甲酸浓度、缓冲盐浓度）对磷酸化肽在C 18/SAX材料上的富集选择性差异， 优化了分离富集条件。在此基础上， 对牛奶中的磷酸化肽进行富集和分析， 效果良好。本方法有望用于实际样品中磷酸化肽选择性富集。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

肽的分析在Nano.LC.ESI.Q.TOF/MS仪器（英国Waters MS Technologies公司）上进行， 离子模式为正离子模式， 喷雾电压为2.0 kV。一级质谱数据采集范围为m/z 500～2000， 二级质谱数据采集范围为m/z 100～2000， 二级质谱的碰撞能为20～40 eV。

乙腈（ACN， 质谱纯， 德国Merck公司）； 甲酸（FA， 色谱纯， 美国Acros公司）； 醋酸铵（NH4Ac， 美国Tedia公司）； NH4HCO 3、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）， α.酪蛋白（Casein）、人血清白蛋白（HSA）、尿素（美国Sigma.Aldrich公司）； 质谱序列级胰蛋白酶（美国Promega公司）； GELoader小柱（德国Eppendorf 公司）。C 18/SAX材料为实验室自制[12]；ZipTip C 18色谱柱（美国Millipore公司）。实验用水为超纯水（美国Millipore纯水系统）；脱脂牛奶购自本地超市。

2.2 蛋白质的酶解

α.Casein的酶解：1.0 mg α.Casein溶于1 mL NH4HCO 3 （50 mmol/L， pH 8.0）溶液中， 按照α.Casein/胰蛋白酶=40∶1（m/m）的比例加入胰蛋白酶， 37℃下酶解反应18 h后， 加入0.5%甲酸终止反应。酶解液最终蛋白浓度为1 mg/mL， 在

20℃保存， 待测。

HSA的酶解：将1.0 mg HSA溶于100 μL含8 mol/L 尿素的50 mmol/L NH4HCO 3， 56℃变性10 min。 加入20 μL 100 mmol/L DTT， 于56℃反应1 h。冷却至室温后， 加入20 μL 200 mmol/L IAA， 在暗处反应 30 min。用 50 mmol/L NH4HCO 3稀释至1 mL后， 按照蛋白质/酶=50∶1（m/m）的比例加入胰蛋白质酶， 37℃酶解12 h后， 加入5 μL甲酸中止反应， 酶解产物于

20℃保存。

脱脂牛奶的酶解： 用Bradford assay法测得脱脂牛奶中蛋白质浓度为20 mg/mL， 用50 mmol/L NH4HCO 3稀释至2 mg/mL， 取100 μL上述溶液按照HSA的酶解方法进行处理， 但是酶解时间延长为16 h。

2.3 磷酸化肽富集条件

按照文献[14]的方法制备GELoader小柱， 每个GELoader小柱装填有1.5 mg C 18/SAX材料， 用于富集磷酸化肽。条件优化实验：α.Casein酶解液86 pmol上样后， 分别用0.1% FA 溶液， 10%、20%、30%和40% ACN/0.1% FA 溶液各20 μL进行洗脱， 考察流动相中乙腈浓度对富集选择性的影响；α.Casein 酶解液上样后， 依次用50% ACN/0.1% FA （pH 4）、0.5% FA （pH 3）、1% FA （pH 2）、2% FA（pH 1）溶液各20 μL进行洗脱， 考察流动相甲酸浓度对富集选择性的影响；α.Casein酶解液上样后， 依次用50% ACN/10 mmol/L NH4Ac、20 mmol/L NH4Ac、50 mmol/L NH4Ac、100 mmol/L NH4Ac、200 mmol/L NH4Ac溶液20 μL进行洗脱， 考察流动相中醋酸铵浓度对富集选择性的影响。优化实验中各个洗脱液， 离心、浓缩干燥后， 用50% ACN/0.1% FA溶液（10 μL）复溶， ZipTip C 18脱盐， 取5 μL进行质谱分析。

在优化的条件下， 进行α.Casein/HSA=1∶20 （n/n）模拟样品以及脱脂牛奶的磷酸化肽富集。将α.Casein与HSA酶解液以摩尔比为1∶20进行混合， 上样量按混合液中α.Casein为86 pmol计。取6 μL牛奶酶解液与20 μL上样溶液混合作为脱脂牛奶的样品溶液。富集后， 收集洗脱液， 离心、浓缩干燥后， 用50% ACN/0.1% FA（10 μL）复溶， ZipTip C 18脱盐， 取5 μL进行质谱分析。

3 结果与讨论

3.1 乙腈浓度对磷酸化肽富集选择性的影响

考察了流动相中乙腈浓度对磷酸化肽富集选择性的影响。实验结果如图1所示， 10% ACN/0.1%FA洗脱馏分中能够检测出5条磷酸化肽的信号， 分别是m/z 770.29 （2+）， m/z 797.83 （2+）， m/z 831.37 （2+）， m/z 907.26 （3+）， m/z 912.53 （3+）， 参考文献[8，14]并根据二级质谱结果确定磷酸化肽的结构信息（表1）。在20% ACN/0.1%FA洗脱馏分中检测出9条磷酸化肽信号， 分别为m/z 733.80（2+）， m/z 770.29（2+）， m/z 797.84 （2+）， m/z 830.88 （2+）， m/z 889.44 （3+）， m/z 971.47 （2+）， m/z 976.45 （2+）， m/z 979.55 （3+）， m/z 991.53 （2+）， 均带有1～3个PO3

4。在高有机相浓度40% ACN/0.1%FA洗脱液中检测出5条磷酸化肽信号， 即m/z 706.69 （2+）， m/z 865.32 （3+）， m/z 924.32 （2+）， m/z 979.36 （3+）， m/z 1339.48 （2+）， 均带有2～5个PO3

4。值得注意的是， 通常情况下， 由于多磷酸化肽极性较强， 其在反相色谱材料上保留弱于单磷酸化肽。而在本研究中， 多磷酸化肽保留强于单磷酸化肽。这可能是磷酸化肽在C 18/SAX材料上的保留是疏水作用和离子交换作用的协同结果。20% ACN/0.1% FA洗脱馏分中少有多磷酸化肽信号出现， 这可能是因为溶液pH=2.5～3.0， 材料表面基团带有正电， 多磷酸化肽pKa值小于流动相pH值， 带有负电， 此时磷酸化肽的保留主要取决于阴离子交换作用， 而单磷酸化肽pKa值大于流动相pH值， 不带电性或带正电， 此时保留主要取决于疏水作用。上述结果表明， 通过改变流动相中乙腈浓度能够实现单、多磷酸化肽顺序洗脱， 磷酸化肽的保留受到疏水和离子交换作用力的双重调控。然而仅通过改变流动相中乙腈浓度进行选择性富集， 存在非磷酸化肽的信号干扰较强、磷酸化肽富集选择性不高的问题。

3.2 甲酸浓度对磷酸化肽在C 18/SAX材料上保留的影响

考察了流动相中甲酸浓度（pH值）对磷酸化肽在C 18/SAX材料上保留的影响（图2）。在保持乙腈浓度（50% ACN）不变的条件下（此浓度能够洗脱出大多数肽）， 考察了流动相中甲酸浓度（0.1%， 0.5%， 1%， 2% FA）对磷酸化肽在C 18/SAX 上保留的影响。当甲酸的浓度为0.1% （pH 4）时， 以单磷酸化肽为主的信号出现， 如m/z 733.79 （2+）， m/z 770.30 （2+）， m/z 797.83 （2+）， m/z 830.43 （2+）， m/z 924.34 （2+）， m/z 964.31 （2+）， m/z 976.43 （2+）， m/z 1029.45 （2+）。当甲酸浓度增加到0.5% （pH 3）时， 多磷酸化肽得以洗脱， 如m/z 1339.98 （2+）， m/z 1002.26 （2+）， m/z 983.29 （2+）， m/z 964.31 （2+）， m/z 893.65 （3+）。当甲酸浓度增加到2% （pH=1）时， 仍然有多磷酸化肽信号出现， 如m/z 964.36 （2+）， m/z 1312.43 （2+）， 但信号强度很低。上述结果表明， 采用C 18/SAX富集α.Casein中的磷酸化肽， 随着溶液中甲酸的浓度逐渐提高（pH值逐渐降低）， 磷酸化肽保留减弱；上样和洗脱溶液中的甲酸浓度分别为0.1%和2%为宜。通过调节流动相pH值能够实现单、多磷酸化肽的分段洗脱， 是因为单磷酸化肽的pKa值大于多磷酸化肽的pKa值；当流动相pH值小于磷酸化肽pKa时， 磷酸化肽不电离， 与SAX材料的离子交换作用减弱， 从而得以洗脱。

3.3 盐浓度对磷酸化肽在C 18/SAX材料上保留的影响

保持流动相中乙腈浓度（50% ACN）不变， 考察了流动相中醋酸铵浓度对磷酸化肽在C 18/SAX上保留的影响（图3）。采用50% ACN/10 mmol/L NH4Ac为流动相时， 洗脱液中主要出现带1～2个PO3

4的磷酸化肽， 如m/z 651.63 （3+）， m/z 733.78 （2+）， m/z 797.82 （2+）， m/z 830.87 （2+）， m/z 841.86 （2+）， m/z 865.30 （3+）， m/z 971.53 （2+）， m/z 976.94 （2+）。 随着流动相中NH4Ac增加到50 mmol/L， 这些磷酸化肽仍然能够洗脱出来。而当流动相中盐浓度提高到100 mmol/L NH4Ac时， 带有3～5个PO3

4的多磷酸化肽得以洗脱， 如m/z 893.65（3+）， m/z 916.90 （2+）， m/z 924.3294 （2+）， m/z 964.31 （2+）， m/z 983.28 （2+）， m/z 1002.26 （2+）， m/z 1339.95 （2+）， m/z 1373.91 （2+）。这是因为在离子交换作用下，多磷酸化肽比单磷酸化肽在C 18/SAX上的保留更强， 提高流动相盐浓度能够减弱PO3

4与C 18/SAX材料的离子交换作用。上述结果表明， 盐浓度的逐渐增高能够实现单、多磷酸化肽分段洗脱， 溶液中盐浓度提高到100 mmol/L NH4Ac时，大多数多磷酸化肽能够被洗脱。

3.4 C 18/SAX材料的富集选择性

将α.Casein酶解液.HSA酶解液（1∶20， n/n）配制的混合样品溶液作为模拟样品， 以20% ACN/0.1% FA和50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac分别作为两步洗脱条件， 分段洗脱单磷酸化肽和多磷酸化肽， 结果如图4所示， 单、多磷酸化肽得到分段洗脱， 其中单磷酸化肽主要出现在20% ACN/0.1% FA馏分中， 共检测到4条单磷酸化肽信号， 如m/z 797.86 （2+）， m/z 830.89 （2+）， m/z 924.69 （2+）， m/z 976.99 （2+）；而多磷酸化肽主要出现在50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac馏分中， 共检测到14条多磷酸化肽信号。与文献[14]的结果相比， 大量非磷酸化肽去除， 磷酸化肽信号强度显著提高；在优化条件下， 单、多磷酸化肽在C 18/SAX材料上能够被同时富集并分段洗脱， 此结果未见文献报道。上述结果表明， 采用优化后的分离条件， 对模拟样品的磷酸化肽富集效果较好。

3.5 牛奶中磷酸化肽的富集

将牛奶样品进行酶解， 然后采用C 18/SAX进行富集和洗脱， 并用纳升电喷雾.四级杆.飞行时间质谱联用系统进行分析。从图5可见， 20% ACN/0.1% FA馏分中出现了4条单磷酸化肽信号， 包括m/z 733.81（2+）， m/z 797.86 （2+）， m/z 831.39 （2+）， m/z 976.98 （2+）。50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac馏分中出现了8条多磷酸化肽信号， 包括m/z 915.96 （3+）， m/z 928.95 （3+）， m/z 964.34 （2+）， m/z 983.33 （2+）， m/z 1002.30 （2+）， m/z 1333.47 （2+）， m/z 1339.51 （2+）， m/z 1373.43 （2+）。从牛奶中鉴定出的多磷酸化肽数目高于文献[5]的结果， 表明所建立方法具有较强的实际应用价值。

4 结 论

本研究将新型分离材料C 18/SAX用于磷酸化肽的选择性富集， 以α.Casein酶解液作为分析样品， 系统考察流动相组成条件对富集选择性的影响。结果表明， 磷酸化肽在C 18/SAX上的保留受疏水作用和离子交换作用的共同影响。在此基础上，建立了单、多磷酸化肽的同时富集和分段洗脱方法， 其中20% ACN/0.1% FA洗脱馏分中主要为单磷酸化肽， 50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac洗脱馏分主要为多磷酸化肽。采用本方法可从α.Casein酶解液和HSA混合液（1∶20， n/n）中分离检测到4条单磷酸化肽信号和14条多磷酸化肽的信号， 从牛奶中共检测到4条单磷酸化肽和8条多磷酸化肽信号。本研究结果表明， 本方法具有较强的实际应用价值 。

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Abstract Selective enrichment before mass spectrometric analysis is very important for detection and identification of phosphopeptides. In this work， a novel method based on the reversed phase/strong anion exchange material （C 18/SAX） was established and applied in phosphopeptide enrichment. The influence of mobile phase composition （acetonitrile content， formic acid content， salt concentration） on the phosphopeptide enrichment selectivity was carried out by taking α.casein digests as model sample. It was found that the retention of phosphopeptides on C 18/SAX was ascribed to both the hydrophobic and strong anion exchange interactions. Mono.phosphopeptides were eluted earlier than multi.phosphopeptides. The retention of phosphopeptides on C 18/SAX was reduced along with the increase of formic acid content and the increase of salt content. After optimization， an enrichment method was developed with 20% ACN/20 mmol/L NH4Ac as loading buffer， 20% ACN/0.1% FA and 50% ACN/100 mmol/L NH4Ac/2% FA as two steps elution phase to fractionate mono.and multi.phosphopeptides. By using the developed method， 4 mono.phosphopeptides and 14 multi.phosphopeptides were isolated from the mixture of α.Casein and HSA at a molar ratio of 1∶20. The application of the developed method to bovine milk digests resulted in the separation and identification of 4 mono.phosphopeptide and 8 multi.phosphopeptides. These results indicated that the methods had great potential for practical application.

Keywords Phosphopeptides； Reversed phase/strong anion exchange material； Enrichment