龙眼和番石榴根际的短针中环线虫鉴定

杨意伯　张绍升

摘 要 短针中环线虫[Mesocriconema brevistylus（Singh & Khera， 1976）Loof & de Grisse， 1989]采自福建省龙眼树和番石榴树的根际土壤中。该线虫的形态学鉴别特征为：唇盘椭圆形，轻微隆起，唇盘两侧的侧器口明显；亚中唇瓣4个，圆形、较发达且充分分离；唇区圆，无缢缩；唇环3个，第2环宽于第1环而窄于第3环；体环126～145个，后翻、后缘光滑，虫体侧区环纹愈合；口针长54.3～66.7 μm；阴门张开，前阴唇无突起物；尾部渐细，末端钝圆或裂叶状。该线虫rDNA-ITS和rDNA-D2D3区的序列大小分别为1 013和767～769 bp。短针中环线虫为中国首次记录，龙眼和番石榴为新发现的寄主植物。

关键词 龙眼；番石榴；短针中环线虫

中图分类号 S436.67 文献标识码 A

Abstract Mesocriconema brevistylus（Singh & Khera， 1976）Loof & de Grisse， 1989 was collected from the rhizosphere of Longan and Guava in Fujian. The morphological diagnostic characters of the nematode are as follows： labial plate oval， elevated slightly， including two distinct amphidial openings laterally； four sub median lobes round， well developed， separated from each other； lip region round， continuous with body， with 3 annules， first annule narrower than second and second narrower than third； body annules 126-145， retrorse， posterior margins smooth， several anastomoses present at lateral field； stylet 54.3-66.7 μm； vulva open， anterior vulval lip with no projection； tail tapering to a lobate or obtusely rounded tip. The nematode's rDNA-ITS and 28S rDNA-D2D3 region sequence was 1 013 and 767-769 bp， respectively. M. brevistylus was firstly reported in China， longan and guava were its new host.

Key words Longan； Guava； Mesocriconema brevistylus

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.020

环科（Ciconematidae）线虫是一类具有环型食道、体环特征明显的植物寄生线虫。中环属（Mesocriconema）线虫外寄生于寄主根系，以口针不断穿刺根组织造成伤口，为其他病原微生物的侵染创造了条件，使根系发育不良，致使寄主地上部过早衰退死亡，如异盘中环线虫（M. xenoplax）是梨树早衰病的主要原因之一[1]。中环线虫的寄主范围广泛，可寄生茶、水稻、麻、烟草、枣、龙眼、柑橘、芭蕉、菠萝、香蕉、咖啡、甘蔗、草果、草坪草等多种作物、果树和草本植物[1-6]。中国报道的中环线虫有15种[7-9]。目前关于龙眼和番石榴根部环线虫的研究较少，龙眼和番石榴根部环线虫种类尚不明确。近年来作者对热带果树线虫病进行了调查，从龙眼和番石榴的果树根际采集到1种中环线虫，对该线虫进行了种的鉴定，现将结果作一报道。

1 材料与方法

1.1 线虫采集和分离

标本采集：采自福州市金山的龙眼树和漳州市南靖的番石榴树的根际土壤。

线虫样本分离和固定：用漏斗法分离线虫，线虫经温热杀死后用TAF固定液固定[1]。

1.2 线虫种类鉴定

1.2.1 形态学观察和显微计测 利用光学显微镜对线虫体形态、体环数目、内部器官结构进行观察和显微计测。计测采用de Man公式和符号：L（体长），W（体宽），a（体长/体宽），b（体长/食道长度），c（体长/尾长），V（体前端至阴门的距离×100/体长），VL（阴门至尾端的距离），VL/VB（阴门至尾端距离/阴部体宽），R（体环数），RB（虫体中部的体环宽度），Rst（唇盘至口针基部之间的体环数），Roes（唇盘与贲门瓣之间的体环数），Rex（唇盘与排泄孔后第1环之间的体环数），Rv（阴门与尾端之间的体环数），Ran（肛门与尾端之间的体环数），Rvan（阴门与肛门之间的体环数），Stylet（口针长度），Stylet cone（针锥长度），m（针锥长度/口针长度），Oes.（食道长度），Ex.P.（排泄孔至头端距离），Tail（尾部长度）。

利用扫描电子显微镜观察线虫体表环纹、唇部等外部结构。采用戊二醛-锇酸双固定法[10]制备线虫样本，用CO2临界点干燥法干燥线虫。挑取线虫至载物台，喷金后观察。

1.2.2 线虫分子鉴定 DNA提取：采用文献[11]的方法提取单条线虫的DNA，所得DNA提取液直接进行PCR扩增。

ITS区扩增：采用通用引物[12]S-ITS1（5′-TTGA

TTACGTCCCTGCCCTTT-3′）和p28S（5′-TTTCACTC

GCCGTTACTAAGG-3′）扩增线虫5.8S rDNA、18S rDNA及28S rDNA之间的内部转录间隔区（ITS）。PCR扩增反应体系和程序与文献[11]相同。

D2D3区扩增：通用引物[13]D2A（5′-ACAAGTA

CCGTGAGGGAAAGTTG-3′）和D3B（5′-TCGGAAGG

AACCAGCTACTA-3′）被用于扩增线虫28S rDNA的D2D3区。PCR扩增反应体系和程序同上。

PCR产物经电泳检测后，回收目的片段，连接PMD-18T载体，转入DH5α大肠杆菌，通过蓝白筛选3个阳性菌落测序。测序后将序列提交至NCBI数据库进行搜索，得到该序列与其他种类中环线虫相应序列的相似性。用软件MEGA 6.0分析序列间同源性，从NCBI数据库下载中环属与其他环科线虫的ITS和D2D3区序列，以半穿刺属线虫（Tylenchulus spp.）作为外群，将序列导入软件，对齐序列，分析方法选择“邻接法”，“Bootstrap”选择1 000，计算完毕后生成系统发育树。

根据虫体形态特征、显微测量数据，及ITS区和D2D3区序列的比对结果，查阅相关文献，确定具体种类。

2 结果与分析

根据光学显微镜和扫描电镜的形态特征观察及形态测量值，rDNA-ITS和28S rDNA-D2D3区序列分析结果，与相关参考文献[14-15]比对，鉴定为短针中环线虫[Mesocriconema brevistylus（Singh & Khera，1976）Loof & de Grisse，1989]（异名：Criconemoides brevistylus Singh & Khera，1976；Macroposthonia brevistylus（Singh & Khera，1976）Ebsary，1979；Criconemella brevistylus（Singh & Khera，1976）Luc & Raski，1981）。

2.1 测量数据（见表1）

2.2 形态描述

雌虫：热杀死后虫体腹向弯曲呈“C”形（图1-A）。体环126～145个，后翻，后缘光滑；虫体侧区环纹愈合，形成“Z”形结构（图1-E～F；图2-E）。唇区圆，顶端平，无缢缩；唇环3个，第1环和第2环不后翻，第3环后翻，第2环宽于第1环而窄于第3环；唇盘轻微隆起，椭圆形，具4个大的亚中唇瓣，边缘圆滑；侧器口明显，紧靠唇盘2侧（图1-C～D；图2-B～C）。口针粗壮，基部球前缘凹陷；环线型食道，排泄孔位于后食道球前至峡部水平处（图1-B）。阴门张开，前阴唇无突起物（图1-G）。阴门后的虫体渐细呈宽圆锥形，尾部末端钝圆或裂叶状（图1-G；图2-F～G）。

雄虫未发现。

2.3 分子生物学特征

2.3.1 ITS区序列比对 ITS扩增片段约为1 100 bp（图3），测序后长度为1 013 bp（Genbank登录号：KC937033）。与Genbank上已登录的中环属、环属（Criconema）和拟鞘属（Hemicriconemoides）线虫的ITS序列的BLAST结果表明，M. brevistylus福州种群与南非种群（JQ231188）相似度最高，为99.6%；与中环属其他线虫M. xenoplax（FN433838，FN433849）、M. obtusicaudatus（JQ231190）和M. curvatum（HM116067）的相似度分别为95%、79%、79%和75%；与环科其他属线虫Criconema sphagni（JQ708133）和Hemicriconemoides spp.（EF126179、EU180057、EU664601、GQ354788和JQ911743）的相似度分别为80%和80%～83%。系统发育树构建结果表明（图4），M. brevistylus福州种群与中环属线虫亲缘关系最近，以支持率81和94归为同一聚类，与M. brevistylus南非种群同源性最高，以支持率100聚为1组。M. brevistylus福州种群与环科其他属线虫的同源性较低，以支持率38和41位于不同分支。

rDNA-D2D3扩增片段约为900 bp（图3），测序后长度分别为767 bp（福州种群）和769 bp（漳州种群）（Genbank登录号分别为KC538862和KC937033），这2个片段之间的序列相似度为99.4%。与Genbank上已登录的中环属、环属、轮属（Criconemoides）和拟鞘属线虫的D2D3序列的BLAST结果表明，M. brevistylus漳州种群与M. brevistylus南非种群（JQ231185）的相似度最高，为99.6%，与中环属其他线虫M. xenoplax（FN433856，FN433861）、M. obtusicaudatus（JQ231187）、M. solivagum（AY780969）和M. sphaerocephalum（AY780950）的相似度分别为87%～92%、90%、87%和81%，与M. ornatum（AY780968）的相似度高达97%，但比对基因覆盖率只有70%；M. brevistylus与环科其他属线虫如Criconema mutabile（AY780954）、Criconemoides informis（AY780970）和Hemicriconemoides alexis（AY780959）的相似度分别为81%，83%和81%。系统发育树构建结果表明（图5），M. brevistylus福州、漳州种群与南非种群同源性最高，以支持率100聚为同一组；这3个种群与中环属其他线虫M. ornatum、M. xenoplax和M. solivagum亲缘关系较近，以支持率91和70聚为一类，与属内M. obtusicaudatus和M. sphaerocephalum亲缘关系较远，处于不同分支；与环科其他属线虫的亲缘关系则更远，位于不同聚类。

2.4 鉴别特征与近似种

鉴别特征：雌虫体长439.7～649.7 μm，体环126～145个，后翻，后缘光滑，虫体侧区环纹愈合；唇区圆，顶端平，无缢缩；唇环3个，第2环宽于第1环而窄于第3环；唇盘轻微隆起，椭圆形；亚中唇瓣4个，圆形、较发达且充分分离，侧器口明显，紧靠唇盘两侧；口针长54.3～66.7 μm；受精囊不明显，阴道直、前倾，阴门张开，前阴唇无突起物；阴门后的虫体渐细呈宽圆锥形，尾端钝圆或裂叶状。

M. brevistylus的形态近似种有：方形中环线虫（M. oblongatum）、阿普雷中环线虫（M. apurense）和沼泽中环线虫（M. palustre）[16-18]。这3种线虫与M. brevistylus的区别是：体长较短（分别为390～400，

380～450和290～490 vs 439.7～649.7 μm）；M. oblongatum的口针短（41.6～44.8 μm）；M. apurense的侧区体环无愈合；M. palustre口针短（46～52 μm）、2个背亚中唇瓣和2个腹亚中唇瓣分别在唇区背、腹面相连。

3 讨论与结论

短针中环线虫福州、漳州种群的形态特征及测量值均与原始描述[14]相符，形态学、分子生物学特征与南非种群[15]相符。但是与原始描述相比，福州种群体环较少（126～145 vs 140～156），漳州种群体环较少（128～132 vs 140～156）而口针较长（59.2～66.7 vs 56～60 μm），这2个种群雌虫的阴门张开，而原始描述的线虫墨线图显示阴门闭合。与南非种群相比，福州种群体环较少（126～145 vs 137～161），漳州种群体环较少（128～132 vs 137～161）、Rex略小（28～36 vs 34～43）、c值略小（16.6～18.7 vs 18～27.5）和口针较长（59.2～66.7 vs 54.5～61 μm）。福州种群与漳州种群的差异在于口针较长（54.3～60.7 vs 59.2～66.7 μm）和Rex略小（33～37 vs 28～36），上述这些差异可能是种群地理分布不同和寄主不同引起的。

据国外报道龙眼根际的中环线虫为圆头中环线虫（M. sphaerocephalum）[18]，番石榴根际有多种中环线虫（Mesocriconema spp.）[18-20]。国内龙眼和番石榴根际的中环线虫尚未见报道。福建省其他作物根际的中环线虫种类有：装饰中环线虫（M. ornatum）、弯曲中环线虫（M. curvatum）和异盘中环线虫（M. xenoplax）[2-3]。M. brevistylus福州种群和漳州种群的唇盘轻微隆起，体环126～145个，前阴唇无突起物，这些特征与上述3种中环线虫都有显著区别：M. ornatum的体环96～106个，前阴唇有2个穗状突起；M. curvatum的体环84～95个；M. xenoplax的唇盘明显隆起，体环82～90个。

据报道短针中环线虫分布于印度的蔬菜和南非的草坪草[14-15]。短针中环线虫为中国首次记录，龙眼和番石榴为新发现寄主植物。目前Genbank有该线虫南非种群的ITS和D2D3区序列数据，国内首次登录该线虫的ITS和D2D3区序列。

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