利用冰冻切片法观察艾纳香叶显微结构

陈晓鹭　刘立伟　杨全　庞玉新

摘 要 应用冰冻切片法观察艾纳香成熟叶的显微结构。结果显示，优化的冰冻切片方法为：取新鲜叶片，不经预处理，直接切取4 mm×4 mm小块，用冷凝胶包埋，冷凝箱温度和样品夹温度-18 °C，冷凝时间10 min，修片后取出并置于室温20 ℃条件下回温30 s，移回样品夹后30 s内切片，切片厚度20 μm，用洁净载玻片吸片，于光镜下观察。成熟艾纳香叶为异面叶，厚度约110 μm；栅栏组织和海绵组织分化明显，栅栏组织由1层排列紧密的柱状细胞组成，海绵组织有发达的细胞间隙，两者之比为0.82～1.22；叶中脉发达，主脉散生，外韧维管束6～10个，由厚壁细胞组成维管束鞘，导管为螺纹；叶上、下表皮均有大量非腺毛和腺毛分布，叶表皮的腺毛为双列多细胞组成的头状腺毛。本研究结果确定了利用冰冻切片研究艾纳香叶显微结构简便可行，为艾纳香属植物分类鉴定、品种整理等提供参考，并为进一步研究艾纳香的结构和发育积累经验。

关键词 艾纳香；娜龙；叶；腺毛；显微结构；冰冻切片

中图分类号 Q944.5 文献标识码 A

Abstract This paper studies the microstructure of sambongs leaf by freeze-sectioning. The optimized method is to collect a fresh and healthy adult leaf and cut a piece from it with an area of 4 mm×4 mm without pretreatment. Then the piece is embedded with Jung tissue freezing medium under -18 ℃ for 10 min， and then placed under room temperature at 20 ℃ for 30 seconds and cut under -18℃ within 30 s. The section thickness is 20 μm. A glass slide is used to stick the section. The section is observed with a optical microscope. The results showed that the ainaxiang leaf is typically bifacial and is with a thickness of about 110 μm. Palisade tissue and spongy tissue in leaves are differentiated. Palisade tissue is composes of columnar cells closely arranged one layer. Intercellular space of spongy tissue is developed. The ratio of palisade tissue thickness to spongy tissue thickness ranges from 0.82 ∶ 1 to 1.22 ∶ 1. Midrib is developed. Six to eight collateral vascular bundles are loosely arranged in midrib. Vascular bundle is consists of spiral vessels inside and sclerenchyma cells around as vascular bundle sheath. Both non-glandular hairs and glandular hairs are occurred frequently in both sides of adult leaves. The glandular hairs are capitate trichomes consists of several cells arrange in two lines. Above results confirm that the feasibility and convenience of studying ainaxiang leaf microstructure with freezing sections. This finding may help better taxonomical study of Blumea plants， and add some information for further study on microstructure and development of this plant.

Key words Blumea balsamifera；sambong；Leaf；Glandular hair；Microstructure；Freezing section

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.006

艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC.]又名冰片艾、大风艾，为多年生菊科（Asteraceae）艾纳香属木质草本药用植物，主要分布在中国的贵州、海南、广东、台湾等地以及菲律宾、越南、马来西亚等国[1-2]，在中国少数民族地区又称之为“娜龙”、“档窝凯”等。艾纳香具有开窍醒神、清热止痛等功效，已有数百年的药用历史，最主要药用部位为叶，是提取中药艾片（左旋龙脑）的唯一资源植物[3]，也是热区新兴的药用经济作物[1]，目前艾纳香植株及其提取物（如艾片、艾粉和艾纳香油等）已被广泛应用于中成药、化妆品、食品等领域。在长期的民间使用过程中，由于艾纳香植株外观特性并不突出，缺乏独特易辨的叶型、叶色、花型或花色等，导致把艾纳香与同属其他种的植物混淆使用的情况时有发生，如六耳铃、柔毛艾纳香等。由于误用或种植了其他植物而影响治疗效果或提取效率的情况时有发生。研究艾纳香的显微结构将有助于理清艾纳香属植物的分类，为其植物学鉴定和分类补充资料，同时为了解和评价艾纳香药材质量积累经验，进而为艾纳香良种选育提供参考。

近年来，围绕艾纳香已经展开多方面研究，包括植物资源[4-5]、化学成分分析[6-12]、提取工艺优化[13-16]、药理功效评价[17-20]、安全性评价[21-22]、功效基因克隆[23]和、田间栽培[24]和组培快繁[25]等，或是探讨其不同生长期的外观形态变化[26]。

随着艾纳香的社会、经济效益逐渐显现，关于艾纳香显微结构观察、鉴定的研究也不断增加。根据艾纳香属的经典分类，艾纳香的总苞片表皮毛全部为非腺毛，即没有腺毛，这是区分艾纳香与同属其他种的重要形态学特征[5，27]，但是，以总苞片表皮毛作为鉴定特征，只能在植物进入花期时进行，使鉴定工作受限于植物生长发育状态，对于幼苗及其他非花期植株，则难以鉴定。林志云[28]利用中药显微鉴定技术研究后认为，艾纳香的表皮上存在腺毛和非腺毛；安军等[29]通过石蜡切片研究认为，艾纳香表皮毛中绝大部分为非腺毛，仅偶见腺毛；池馨等[30]通过石蜡切片研究认为，艾纳香叶含有分泌细胞，但是，未阐明分泌细胞的类型和形态，也未指出其是否具有腺毛。前人通过直接观察、石蜡切片和粉末观察等方法为研究艾纳香的显微结构积累了经验，但关于其表皮毛的描述尚未达成一致。

冰冻切片技术操作便捷、耗时短，切片厚度可调范围大，易于保留叶片表皮的毛状结构[31]。为进一步了解艾纳香的形态学特征，为其补充植物分类和鉴定资料，完善基于显微观察的艾纳香评价手段，有必要利用冰冻切片技术对艾纳香叶的结构进行进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所使用的植物材料引种自海南省儋州市郊，经中国农业科学院热带作物品种资源研究所南药研究室庞玉新研究员鉴定，为艾纳香属植物艾纳香。经引种，保存在位于海南省儋州市的农业部儋州热带药用植物种质资源圃中，露天栽培，常规水肥管理。

1.2 方法

1.2.1 冰冻切片方法的优选 （1）不同冷凝温度对艾纳香叶冰冻切片的效果比较。取新鲜叶片，用锋利刀片切取叶片中部至边缘的一部分叶片，大小为4 mm×4 mm的方块，使用冰冻切片机专用的莱卡 （Leica）Jung组织冷冻剂（批号：03663438 2013 06）在载物台上直接包埋，分别在-10、-18、-28 ℃环境下冷凝10 min，修片后切片，切片厚度为20 μm，用洁净载玻片吸贴，在Leica DMI4000B数码光学显微成像系统下观察并拍照，比较切片效果。

（2）不同冷凝时间对艾纳香叶冰冻切片的效果比较。取新鲜叶片，用锋利刀片切取叶片中部至边缘的一部分叶片，大小为4 mm×4 mm的方块，使用Jung组织冷冻剂在载物台上直接包埋，分别于-18 ℃下冷凝5、10、30 min，修片后切片，切片厚度为20 μm，用洁净载玻片吸贴，在Leica DMI4000B数码光学显微成像系统下观察并拍照，比较切片效果。

（3）不同回温操作时间对艾纳香叶冰冻切片的效果比较。取新鲜叶片，用锋利刀片切取叶片中部至边缘的一部分叶片，大小为4 mm×4 mm的方块，使用Jung组织冷冻剂在载物台上直接包埋，于-18 ℃下冷凝10 min后修片，分别回温[32][将载物台连同包埋块拿到切片机冷冻箱外，在室温（20 ℃）环境下放置一段时间，使包埋块温度回升]0、10、30、90 s后将其重新固定在样品夹上，30 s内切片，切片厚度为20 μm，用洁净载玻片吸贴，在Leica DMI4000B数码光学显微成像系统下观察并拍照，比较切片效果。

1.2.2 艾纳香叶片冰冻切片与观察 试验采用优化后的冰冻切片法对艾纳香叶显微结构进行切片，具体步骤：取洁净健康无病虫害的新鲜成熟叶片，用锋利刀片切取叶片中部至边缘的一部分叶片及叶片中部的主脉各一方块（4 mm×4 mm），使用Jung组织冷冻剂固定，在载物台上直接进行包埋，分别在-18 ℃环境下冷凝10 min，待材料迅速冷却并固定在载物台上后进行修片，回温[32]30 s后重新将其固定在样品夹上，在30 s内进行切片，切片厚度为20～30 μm，用洁净载玻片吸贴[33]，在德国莱卡（Leica）DMI4000B数码光学显微成像系统下观察并拍照。

1.3 数据统计与分析 包埋块稳定度按以下公式计算：包埋块稳定度/%=（1-修块或切片过程中脱落的包埋块个数/包埋块总数）×100；照片经Adobe Photoshop CC图像处理系统处理制版；数据分析采用IBM公司的 SPSS（Statistical Product and Service Solutions）19.0軟件进行，数据记录格式为平均值±标准误差（SD）。2组数据的差异显著性分析使用独立样本t检验；3组或以上数据的差异显著性分析使用邓肯氏多重范围比较（Duncans New Multiple Range Test），差异显著性水平定为p<0.05。

2 结果与分析

2.1 冰冻切片方法的优选

2.1.1 不同冷凝温度对艾纳香叶冰冻切片的效果比较 分别比较了冷凝温度为-10、-18、-28 ℃（冷凝10 min时）的切片效果，结果见表1和图1，包埋稳定度随冷凝温度的下降而上升，冷冻箱和样品夹的冷凝温度均设定为-18 ℃时效果较好（图1-A）。当温度为-10 ℃时，叶片横切面结构被挤压变形，且修块和切片过程中包埋块容易脱落；当温度为-28 ℃时，叶片组织容易碎裂，造成切片不完整（图1-B）。

2.1.2 不同冷凝时间对艾纳香叶冰冻切片的效果比较 从表2可知，包埋稳定度随冷凝时间的延长而上升。在-18 ℃冷凝10 min最适合，此时切片较完整（图2-A）。冷凝时间为5 min时，冷凝胶未能完全凝固，且贴紧载物台，在修片和切片的过程中，容易导致包埋块滑落；冷凝时间为30 min时，样品组织发生碎裂，难以观察完整的组织形态（图2-B）。

2.1.3 不同回温操作时间对艾纳香叶冰冻切片的效果比较 从表3可知，包埋稳定度随回温时间的延长而有所下降，但在90 s内下降不显著。在对艾纳香叶进行冰冻切片时，适当进行回温操作有利于获得结构完整的切片。在冷凝温度为-18 ℃、冷凝时间为10 min、室温为20 ℃的条件下，回温时间为30 s效果最佳（图3-A）。回温时间为10 s时，切片结果与不进行回温操作的结果相似，均容易使组织破碎；回温时间为90 s时，容易导致切片实际厚度大于设定的厚度，且艾纳香的叶肉结构变形（图3-B）。

2.2 艾纳香叶片冰冻切片与观察

艾纳香叶为羽状网脉，成熟中脉和侧脉在上面可辨，下面明显凸起（图4-A）。横切面上，中脉最粗。叶中脉处，上表皮细胞与维管束之间靠近表皮处有6～9层细胞壁加厚的厚角组织，与两边的栅栏组织相连，厚角组织以内有3～8层薄壁细胞。下表皮细胞外角质层有明显加厚，下表皮内2～6层为厚角组织，其内为6～7层较疏松的薄壁细胞，薄壁细胞较大，两侧与两边的海绵组织相连。上、下表皮均有大量表皮毛分布，有非腺毛和腺毛。叶中脉横切面上，维管束呈扇形排列，为外韧维管束，约4～11个，维管束的韧皮部外有厚角组织构成的维管柱鞘。木质部导管为螺纹导管。

成熟叶片厚度为（110.19±1.01）μm，叶肉组织发达，栅栏组织和海绵组织的分化明显。栅栏组织由1层排列较紧密的柱状细胞构成，厚度为（36.10±0.44）μm，含有丰富的叶绿体；海绵组织细胞排列较疏松，细胞间隙发达（图4-B），厚度为（44.26±0.92）μm，栅海比为0.82～1.22。

叶片横切面上、下表皮细胞大小相近，多为不规则形或近方形，叶脉下表皮处表皮细胞为规则的圆形或近方形（图4-B）。上表皮厚度为（17.45± 0.42）μm，下表皮厚度为（7.87±0.22）μm，独立样本t检验结果显示，上表皮厚度显著大于下表皮厚度。上、下表皮均可见非腺毛和腺毛分布，大部分腺毛长度约为48 μm。腺毛的形态为头状腺毛，由基细胞、柄细胞和分泌细胞组成，其中，基细胞1个或2个并排，柄细胞1～2对并排形成，分泌细胞1～6对，顶部的分泌细胞由1对半球形细胞并排形成，在分泌细胞外可见由分泌物构成的一层半透明囊泡包裹（图4-C）。

3 讨论与结论

前人对艾纳香叶显微结构的研究主要是通过石蜡切片技术或中药显微鉴定的手段对包含叶在内的全草粉末进行显微观察[28-30]。相对于石蜡切片，本研究通過使用冰冻切片进行操作，观察和统计结果与前人利用石蜡切片所观察到的叶肉部分的显微结构特征[30]一致，确定利用冰冻切片技术对艾纳香叶的显微结构进行观察的方法可行。此外，利用冰冻切片操作具有操作简便、节省时间等优点[31-32]，便于大量操作，在研究艾纳香叶的数量性状方面更具有较大的优势，如用于评估其显微结构差异与有效成分积累差异之间的关系等。

优化后的艾纳香叶冰冻切片方法为：取新鲜叶片，不经预处理，直接切取4 mm×4 mm的小块，用冷凝胶包埋，冷凝箱温度和样品夹温度均为-18 ℃，冷凝时间为10 min，修片后取出并将其置于室温（20 ℃）条件下回温30 s，移回样品夹后30 s内切片，切片厚度为20 μm，用洁净载玻片吸片，于光学显微镜明场下观察并拍照记录。

精油是艾纳香叶中具有重要生物活性的内含物[2，20-21]，而关于艾纳香的精油分泌结构的类型与特征尚未有定论。艾纳香叶上、下表面均附有长而浓密的非腺毛，不易移除，阻挡视线，增加了对叶表皮其他结构直接观察的难度。至今，关于艾纳香表皮毛中是否存在腺毛及腺毛的多寡尚存在一些争议[27-30]。本研究通过进行冰冻切片，确定了腺毛大量存在于艾纳香叶表面，获得了完整、清晰的艾纳香叶表皮腺毛的照片，可清晰地观察到由双列多细胞排列而成的头状腺毛。这些结果支持了部分学者认为艾纳香存在腺毛的观点[29]，池馨等[30]虽未明确阐述艾纳香表皮腺毛存在与否，但从其石蜡切片照片中可辨认出部分结构与本研究所观察到的腺毛结构一致。不过，在本研究的艾纳香叶表皮中仅观察到一种腺毛，即双列多细胞排列的头状腺毛，未观察到林志云[28]报道的单列细胞排列的头状腺毛，可能是因为本研究观察对象为成熟叶片，而前人观察的是全草粉末，即由于观察的植物部位范围不同或观察的材料状态不同所致。本研究结果确定利用冰冻切片技术观察艾纳香表皮毛的方法可行，且相对于石蜡切片而言，不需要有机溶剂固定，更快捷便利；相对于粉末显微观察而言，不需要进行干燥、打粉等处理，对艾纳香及更多植物的分类、鉴定、观察具有参考价值；此外，通过本研究可知，艾纳香表皮在非腺毛覆盖之下具有大量腺毛，这也为从显微结构角度研究和评价艾纳香精油的积累模式提供参考。

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