胡椒PnNPR1基因的克隆与表达分析

范睿　郝朝运　胡丽松　伍宝朵　邬华松

摘 要 根据胡椒病程相关基因非表达子1（Nonexpressor of pathogenesis-related genes1， NPR1）基因的部分序列设计引物，运用RT-PCR方法获得其家族成员的1个全长cDNA，命名为PnNPR1，长度1 712 bp，开放阅读框1 362 bp，编码454个氨基酸。预测 PnNPR1分子量为141.56 ku，理论等电点为4.98。该基因含有BTB/POT结构域、ANK锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域，具有植物NPR1所共有的保守结构域。系统进化分析表明，PnNPR1与苜蓿的同源性最高。Real-time RT-PCR 结果表明，PnNPR1在胡椒叶片、根、茎和花中均表达，在叶中的表达量最高。辣椒疫霉菌诱导后，PnNPR1基因的表达量在抗/感2种胡椒中均出现先增加后减少的现象，并且在抗病种质中表达量较高。研究结果为PnNPR1的功能研究提供了理论依据。

关键词 胡椒；病程相关基因非表达子1；克隆与表达

中图分类号 S573 文献标识码 A

Abstract The full-length cDNA encoding Nonexpressor of pathogenesis-related genes1（NPR1）， designated as PnNPR1， was isolated from black pepper by using PCR. The sequence of PnNPR1 was 1 712 bp in length， containing a 1 362 bp open reading frame， and encoding a polypeptide of 454 amino acids with a calculated molecular weight of 114.56 ku and a pI of 4.98. The protein had four conserved domains of BTB/POT， ANK anchored protein repeat sequences， DUF and NPR1-like C. The phylogenetic analysis showed that PnNPR1 had a closer relationship with Medicago truncatala. Real time quantitative PCR analysis showed that the expressions of PnNPR1 were differentially expressed in the root， stem， leaf and flower of black pepper. When P. capsici infected， PnNPR1 was significantly higher in resistant germplasm than in susceptible germplasm， and all time point of expression of PnNPR1 were up-regulated by infected. This result would generate an important theoretical and practical significance for black pepper genetic improvements.

Key words Black pepper； Nonexpressor of pathogenesis-related genes1（NPR1）； Cloning and expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.013

胡椒（Piper nigrum）具有重要的药用和工业价值，是世界最重要的香辛作物之一[1-3]。据FAO统计，世界胡椒收获面积5.53×105 hm2，总产量达4.33×105 t，其中中国胡椒主要分布在海南、云南、广东和广西等地，年产量2.72×104 t，位居世界第五[4]。随着胡椒新功能的不断挖掘和人们饮食结构的变化，中国对胡椒的需求量还将大幅增加。目前中国主栽品种为热引1号（P. nigrum c.v. Reyin-1），又称印尼大叶种，中感胡椒瘟病，生产上仍采取预防为主、综合防治为辅的措施，大大增加了种植生产成本[5]。胡椒主栽品种抗瘟病能力差已成为限制中国胡椒种植面积进一步扩大的重要因素，威胁着胡椒产业健康发展，因此选育适合中国气候环境特点的高产、高抗新品种是产业发展的迫切需要。

转基因育种可定向改良特定性状，缩短育种周期，是培育作物新品种的重要手段。长期以来，传统的作物育种技术为杂交、诱变育种，但存在育种周期长、选择准确性差、育种效率低等缺点，特别是应用于多年生木本植物时更加明显。转基因技术既可在受体中表达受体的同源基因，也能打破物种限制，在受体中表达来自于不同受体的外源基因，从而达到定向改良某一或某些性状的目的[6]。病程相关基因非表达子1（Nonexpressor of pathogenesis-related genes1， NPR1）是植物抗病信号传导途径的关键调控基因。NPR1基因是植物抗病信号传导途径一个关键的调控基因，激发植物防御机制产生系统获得性抗性，增加防御反应强度和速度，使植物具有广谱抗病性[7]。近年来，国内外科学家较为系统地研究了NPR1基因包括NPR1基因的结构、作用机理、在植物抗病中的作用，预测在抗病育种中的应用前景等。自1994年首次从拟南芥分离得到NPR1基因，并陆续转入到不同类型作物中。2001年，Park等[8]将拟南芥NPR1基因超表达载体导入到水稻中发现转基因植株对细菌性枯叶病原体（X00）的抗性提高了，通过RNA点杂交发现转基因植株抗病性的提高是因为NPR1基因的高表达，首次证明了NPR1基因可以提高单子叶植物抗病性。同样，在一些重要的经济作物中如烟草、油菜、西红柿、甘蓝、椰菜、马铃薯、玉米、小麦发现同源基因，并且其调控机制基本一致[9-10]。大量研究表明，转NPR1基因可提高转基因作物对部分真菌和细菌的抗性，具有巨大的潜在应用价值。但是，目前还没有关于NPR1基因在胡椒中的克隆与表达研究。

本研究拟通过RT-PCR法从胡椒中克隆NPR1抗病关键基因，分析其表达模式，为今后胡椒遗传改良、转基因育种等提供重要依据，具有重要的理论及现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及处理 试验材料热引1号胡椒来自胡椒标准化种植示范园，为中国主栽品种，中感胡椒瘟病；黄花胡椒（Piper flaviflorum）来自农业部胡椒种质资源圃，为栽培种的野生近缘种，中国特有物种，主要分布在云南东南和西南部，高抗胡椒瘟病。切取健壮无病虫害的当年生主蔓，修剪成长度约40～60 cm、具4～7节和6～12片叶的扦插苗，采用沙培法植于温室中，待生根后进行针刺接种。将辣椒疫霉菌孢子用无菌水稀释至每毫升约5×106个，用于针刺接种。抗/感种质材料种苗均分为2组，按照如下方式进行：一组材料作为接种组，每个苗针刺3次；另一组作为对照组，用无菌水替代病原孢子液，同方法针刺接种。针刺处理在30 min内完成。根据Panstruga等[11]研究，接种后48 h 内是病菌孢子萌发、侵染以及植物体内受体识别侵染信号并做出反应的关键时期，因此接种组取样时间为未处理即0 h，以及处理后的8，12和24 h，分别取接近主蔓的根部组织用于后续试验。取样后立即投入液氮中，并迅速转移至实验室-80 ℃保存备用。

1.1.2 试剂及核酸测序 RNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自Axygen公司，逆转录酶、pMD18-T载体、大肠杆菌DH5α菌株购自TaKaRa公司，SYBR Green qRT-PCR试剂盒购自伯乐有限公司，核酸测序和引物合成委托上海英骏生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 参照试剂盒方法提取总RNA。取2 μg RNA样品根据反转录试剂盒说明书合成cDNA。

1.2.2 胡椒NPR1基因的克隆 搜索胡椒EST数据库（SRS856941），根据CL4128.Contig2_F0463-PN序列设计引物CL4128-F-S和CL4128-F-A（表1），以胡椒根部组织cDNA为模板进行PCR扩增，程序为：94 ℃预变性4 min，30个循环（94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min）72 ℃延伸7 min。PCR 产物（基因片段A）回收后连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序。

1.2.3 胡椒PnNPR1序列的生物信息学分析 利用NCBI网站中的BlastX对序列进行比对，系统进化分析选取同源性>30%的序列进行。蛋白理化性质分析利用Protparam在线分析软件（http：//web.expasy.org/protparam/）进行，用Prosite数据库分析氨基酸序列的功能域，预测蛋白是否存在信号肽和亚细胞定位使用PredictProtein工具（https：//www.predictprotein.org/），用SPORT软件（http：//psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl）进行亚细胞定位分析，用PHD工具分析蛋白二级结构，利用DNAman软件构建同源性和系统进化树。

1.2.4 PnNPR1定量PCR分析 以PnHistone3基因为内参对照，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ进行定量PCR分析，引物序列见表1。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35个循环。每个样品进行3次重复，所有的样品数据分析，相关基因的表达使用2-△△CT方法定量，结果为平均值±SD。统计学分析采用SPSS20.0统计分析软件进行数据处理，定量比较采用t检验方法，以p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 PnNPR1基因cDNA序列的克隆

基于已获得的胡椒EST序列片段，在目的基因的5′端和3′端设计引物扩增出目的基因，获取2 kb左右片段。去除载体序列，该基因全长1 712 bp，包含一个1 362 bp的完整开放阅读框，编码454个氨基酸残基的蛋白质，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，5′端非编码区326 bp，3′端非编码区32 bp，推测的氨基酸与核酸序列见图1。

2.2 生物信息学分析

PnNPR1蛋白的分子式为C5 212H8 714N1 712O2 198S344，编码454个氨基酸残基，相对分子质量为141.56 ku，等电点为4.98，理论推导半衰期大于10 h，属于不稳定蛋白。该蛋白中相对含量比较多的氨基酸是Thr（485个，28.3%）、Ala（474个，27.7%）、Gly（409个，23.9%）、Cys（344个，20.1%），Pyl和Sec的含量为0。总的带负电荷的残基（Asp+Glu）和正电荷的残基（Arg+Lys）均为0，亲水性平均数为0.707，预测该蛋白为水不溶性蛋白。根据SPORT软件分析结果，预测该基因主要分布在细胞核（47.8%）和细胞质（34.8%）中，无信号肽。NCBI对其保守结构域进行分析表明，该基因含有ANK锚蛋白重复序列、BTB/POT结构域、DUF和NPR1-like C等4个结构域（图2）。

蛋白质多肽链通常折叠和盘曲成比较稳定的空间结构，蛋白质的空间结构与其特定生物学功能密切相关。常见的二级结构有α-螺旋（α-helix）、β-折叠（β-pleated sheet）、β-转角（β-turn）、无规则卷曲（Random coil）、延伸链（extend strand）等。PHD软件分析表明，PnNPR1主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链构成，3种结构所占比例分别是60.49%，25.17%和7.73%（图3），可见α-螺旋是PnNPR1最主要的二级结构。

从NCBI网站上获取其他作物的NPR1氨基酸序列，将PnNPR1氨基酸序列与其它植物的NPR1比较，发现PnNPR1与苜蓿（Medicago truncatula）、葡萄（Vitis vinifera）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）等作物的NPR1家族成员的同源性分别达到63.4%，46.4%，46.2%和46%（图4）。构建的进化树表明，PnNPR1最先与苜蓿NPR1聚合；与番茄、葡萄、杨树、大豆序列进化距离均较远，推测这种现象可能与物种起源地有关，同时胡椒是基部被子植物中最大的属之一，属于传统的木兰亚纲（图5）。

2.3 PnNPR1的表达模式分析

以histone3为内参，用real-time PCR方法分析PnNPR1表达模式。结果显示，PnNPR1在热引1号胡椒不同组织中均有表达，表达水平从高到低依次为叶、茎、根、花（图6）。

以病原菌侵染后不同时间点的根部cDNA为模板进行qPCR分析来研究PnNPR1基因的表达特征，结果表明：在处理前，黄花胡椒与热引1号胡椒的PnNPR1表达量均较低，辣椒疫霉菌诱导后，PnNPR1基因的表达量在2种种质中都明显增加，随着处理时间的延长，该基因呈现出先增加后降低的变化趋势；处理后12 h表达量达到最大，随后开始下降，并且，所有处理时间下，黄花胡椒的表达量均大于热引1号胡椒（图7）。

3 讨论与结论

项目组前期研究中获得了一个与NPR家族蛋白具有高度同源性的EST特异序列[12]，根据此序列从胡椒中克隆得到一个NPR1基因，将其命名为PnNPR1。对该基因进行生物学信息分析，预测该蛋白为水不溶性蛋白，主要分布在细胞核和细胞质中，研究表明NPR1功能发挥非常必要的条件就是核定位特性[13]，NPR1蛋白在非诱导状态下通常以多聚体形式存在于细胞质内，一旦发生SAR诱导，NPR1蛋白氧化为单体并转移到核内，与多种TGA转录因子相互作用并激活PR基因表达，最后导致植物产生免疫反应[14]。PnNPR1基因同时具有植物NPR1所共有的保守结构域，其中BTB/POT结构域、ANK锚蛋白重复序列这2个结构域对NPR1基因发挥其功能极为重要，同时涉及蛋白质与蛋白质之间的相互作用，前期对这些区域高保守的氨基酸进行点突变的结果验证了这一说法[15-17]。另有研究表明NPR1基因与TGA转录因子结合的必要元件是ANK结构域，正向调控PR基因表达，使植物产生SAR[18]，推测NPR1可能通过与其它蛋白的相互作用参与调节植物防卫反应。

本研究中，接种辣椒疫霉菌后不同时间下，PnNPR1基因在根、茎、叶和花中均有表达，且表达存在明显差异，其中叶片中的表达量最高，花的表达丰度最低。这与荆州黑麦ScNPR1基因的表达相似，均在叶中表达量较高，而拟南芥AtNPR1基因、水稻OsNPR1基因均无组织特异性表达，推测NPR1组织特异性表达可能与不同物种有关。

NPR1是SAR的一个中心元件，表达在PR基因之前，但在SA积累之后阻止SAR信号的发生[19]。NPR1基因在正常植株中有少量表达，当用SA或INA处理[20]或病原菌侵染时[21]，其表达量可提高大约2～4倍，本研究发现胡椒PnNPR1基因在辣椒疫霉菌侵染下表达量都升高，且不同时间段其表达差异显著，在12 h下到达最高值，产生这一现象可能是因为PnNPR1的转录受到病原菌的反馈机制调节，使蛋白维持在一定的水平，进一步说明了PnNPR1基因调控胡椒瘟病及信号传导中的重要作用。研究同时显示，将从水稻中克隆的OSNPR1基因在水稻中高表达，能够提高该作物对白叶枯病和稻瘟病的抗性[22]；从抗黄枯萎病海岛棉克隆获得GbNPR1基因，将其转入到烟草中，可显著提高转基因烟草对赤星病菌的抗性，且其转录水平受棉花黄萎病原菌诱导[23]。另外，本研究发现，胡椒抗病种质（黄花胡椒）与感病种质（热引1号胡椒）受辣椒疫霉菌侵染后表达存在差异，不同时间段抗病种质的表达量都略高于感病种质，这说明不同抗性水平的胡椒种质PnNPR1基因的表达模式也存在一定的差异，这与橡胶树HbNPR1基因的表达结果相近[24]。抗病种质PnNPR1基因表达增强，有助于激活下游防卫基因的表达，从而产生系统获得抗性。本研究中胡椒PnNPR1基因的获得及其表达模式为开展PnNPR1功能与分子机制的研究及培育胡椒新品种奠定基础。

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