黄瓜酪氨酸硫化转移酶基因CsTPST克隆及其表达分析

杜亚琳

摘要：【目的】克隆黄瓜酪氨酸硫化转移酶基因（CsTPST），并分析植物多肽在发育过程中的调控作用，为研究CsTPST的功能及多肽与乙烯在黄瓜发育过程中的相互作用打下基础。【方法】以拟南芥TPST蛋白序列信息为基础进行同源比对，经PCR扩增和生物信息学分析获得CsTPST基因序列信息、结构和亲缘关系，并利用qRT-PCR对其表达模式进行分析。【结果】CsTPST基因cDNA全长789 bp，编码262个氨基酸。进化分析结果表明，CsTPST蛋白与甜瓜的TPST蛋白亲缘关系最近，其氨基酸序列相似性为93%。qRT-PCR分析结果表明，CsTPST基因在黄瓜雌花、根和叶片中表达量较高，在雄花和茎中表达量较低。此外，CsTPST基因在乙烯合成促进剂ACC处理的黄瓜叶片中上调表达，而在乙烯合成抑制剂AVG处理下呈下调表达。CsTPST基因启动子能激活GFP基因的表达。【结论】CsTSPT基因是一个受乙烯诱导表达的基因，可供开展CsTPST基因的生物学功能及性别决定的分子机理研究参考。

关键词： 黄瓜；CsTPST基因；多肽；qRT-PCR；乙烯

中图分类号： S642.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）09-1457-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to clone tyrosylprotein Sulfotransferases gene in Cucumis sativus L.（CsTPST） and analyze regulatory role of plant peptides in development of C. sativus L.， in order to lay a foundation for analysis of function of CsTPST and interaction between peptide and ethylene in development of C. sativus L.【Method】Homology alignment was conducted based on TPST protein sequence in Arabidopsis thaliana. sequence， gene structure，phylogenetic relationship，and expression pattern of CsTPST were obtained through PCR amplification and bioinformatics analysis， and the expression pattern was studies through qRT-PCR. 【Result】Gene cDNA in CsTPST was 789 bp in length，and encoded a protein with 262 amino acids. Phylogenetic analysis indicated that CsTPST exhibited the highest similarity with TPST from melon，with 93% of amino acid sequence similarity. qRT-PCR analysis showed that CsTPST gene had high expression level in female flowers，roots and leaves，while it had relatively low expression level in male flowers and stems. More interestingly，CsTSPT gene expression was up-related in cucumber leaves under ACC（an ethylene synthesis promoter） treatment，while down-regulated under AVG（an ethylene synthesis inhibitor） treatment. CsTPST gene promoter could activate expression of GFP gene. 【Conclusion】The results revealed that CsTSPT is an ethylene-induced gene， which can provide reference for research on biological function and molecular mechanism of sex determination.

Key words： Cucumis sativus L.； CsTPST gene； peptide； qRT-PCR； ethylene

0 引言

【研究意義】黄瓜（Cucumis sativus L.）性型较丰富，是研究植物性别决定的模式材料，但其调控机制目前尚不明确。植物多肽作为一种新型激素，对植物的多个生长和发育过程均有调控作用，但其是否调控黄瓜性别决定也尚未明确。因此，研究分析植物多肽在黄瓜发育过程中的调控作用，对开展植物多肽对黄瓜生长发育的调控作用研究及利用植物多肽调控黄瓜性型具有重要意义。【前人研究进展】Matsubayashi和Sakagami（1996）、Matsubayashi（2014）研究发现，植物硫肽激素（Phytosulfokine，PSK）以两种形式存在，即PSK-α和PSK-β，其中，PSK-α是一种含5个氨基酸的磺化短肽Tyr（S03H）-Ile-Tyr（S03H）-Thr-Gln-0H。Matsubayashi（2011，2014）研究认为，植物多肽（如系统素和PSK）参与了植物生长发育的多个过程。Yamamuro等（2016）研究发现，植物激素（如生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯等）的相互作用可在植物生长发育过程中发挥重要调控作用。PSK作为能剌激植物细胞活性的肽类信号分子存在于多种植物细胞中，对植物生长发育的其他调节功能也陆续被鉴定（Yamada and Sawa，2013；Matsubayashi，2014）。植物多肽通常通过复杂的翻译后修饰过程来行使其生物学功能，酪氨酸硫化则是一种在高等动物和植物中普遍存在的蛋白质翻译后修饰现象，此过程由酪氨酸硫化转移酶（Tyrosylprotein sulfotransferases，TPST）所介导（Matsubayashi，2014）。动物的TPST存在于各种组织和细胞中，在结构上与植物的TPST存在较大差异（Komori et al.，2009；Matsuzaki et al.，2010）。Komori等（2009）、Matsuzaki等（2010）研究表明，植物的TPST在植物多肽激素PSK和PSY1发挥生物活性过程中尤为重要。目前，人们已从植物中鉴定出TPST基因。拟南芥AtTPST是一个定位于高尔基体的Ⅰ类跨膜蛋白，其在植物的各组织中均可表达且以在根分生组织中的表达量最高（Komori et al.，2009）。此外，AtTPST的表达受生长素和BR诱导（Zhou et al.，2010；Hartmann et al.，2013）。【本研究切入点】黄瓜是我国重要的蔬菜作物，植物激素在黄瓜发育过程中发挥重要调控作用，乙烯在黄瓜性别决定过程中的作用尤为重要（Fulton et al.，1995；Wu et al.，2015）。目前有关TPST介导植物多肽PSK调控植物发育的研究进展较快，但人们对PSK调控黄瓜的发育进程（如性别决定）了解较少。【拟解决的关键问题】克隆黄瓜TPST基因（CsTPST），探明PSK和乙烯在黄瓜发育过程中的相互作用，为研究黄瓜发育过程中CsTPST基因的功能、植物多肽对黄瓜生长发育的调控作用及利用植物多肽调控黄瓜性型等打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

黄瓜津优10号购自天津科润黄瓜研究所，雌性系黄瓜唐秋208购自唐山市农业科学研究院，强雄黄瓜材料ZL18由农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室保存提供。2015年春季播种于东北农业大学农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室光照培养箱。分别取幼嫩叶片、雌花、雄花、茎和根等组织，用液氮冷冻并于-80 ℃保存，用于RNA提取。

1. 2 激素处理

黄瓜植株采用MGRL营养液配方进行水培。每7 d更换1次营养液。在3叶1心期对黄瓜幼苗叶片分别进行乙烯合成促进剂ACC（1 μmol/L）、乙烯合成抑制剂AVG（1 μmol/L）、IAA、GA3和CTK等激素处理，以ddH2O为对照（CK），每2 d处理1次，共处理3次，最后1次处理后3 d取材并提取RNA用于后续分析。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法进行总RNA提取，利用单逆转录（RT）试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，MBI公司）合成cDNA。

1. 4 基因组DNA提取

取黄瓜植株嫩叶，用CTAB法（Fulton et al.，1995）进行DNA快速提取。提取的DNA加水溶解，于-20 ℃保存备用。

1. 5 CsTPST基因克隆

参考拟南芥基因组数据库中TPST（AT1G08030）序列信息，在黃瓜基因组数据库（http：//www.icugi.org）中比对获取其同源基因序列Csa1M126020。利用Primer Premier 5.0设计特异引物（5'-ATGAATGCTATCTTGTGGGGCCTTC-3'和5'-TTATACCTTAACTTTAGATACTCT-3'），PCR扩增CsTPST基因序列，并将PCR产物送至上海英骏生物技术有限公司进行测序。

1. 6 生物信息学分析

将克隆获得的CsTPST基因序列在NCBI中进行BLAST同源比对分析，并将其蛋白序列与同源基因蛋白序列（拟南芥AT1G08030，甜瓜XP_008462687，麻风树XP_012064805，荷花XP_010253702，白杨XP_011044393）进行同源性比对。

1. 7 qRT-PCR分析

qRT-PCR分析以β-actin基因作内参，以经ACC（50 μmol/L）、AVG（50 μmol/L）、IAA（50 μmol/L）、GA3（50 μmol/L）和CTK（50 μmol/L）处理的黄瓜叶片及未经激素处理（对照，CK）的不同组织（叶片、根、雌花、雄花和茎）、不同发育阶段（播种后30和50 d）的津优10号叶片、雌性系黄瓜唐秋208和农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室保存的强雄黄瓜材料ZL18茎间为材料，以CsTPST基因的cDNA序列为基础，利用Primer Primer 5.0设计特异引物（正向引物5'-TCTAACTGCGGAACATAAGGA-3'、反向引物5'-TCTAAGGTACTATTATTCTGA-3'）。qRT-PCR试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司的Real Master Mix SYBR Green Ⅰ，仪器为IQ5实时定量PCR仪（伯乐公司）。基因相对表达量采用2-△△Ct法进行计算，3次重复。

1. 8 启动子序列分析

将CsTPST基因编码区序列在黄瓜基因组网站（http：//www.icugi.org/）进行比对，获得其在基因组上位置的信息，进而在黄瓜基因组网站上获得其上游约2000 bp的启动子序列，并通过启动子元件分析数据库PLACE（http：//www. dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/）对CsTPST基因启动子序列中调控元件进行分析。

为测试CsTPST基因启动子的活性，利用pGII载体上的多克隆位点（Sac I和BamH I），在35S启动子两端设酶切位点，构建带有GFP报告基因的嵌合启动子载体。利用基因枪轰击法在洋葱表皮细胞中进行瞬时转化，进而利用激光共聚焦对启动子活性进行分析。

2 结果与分析

2. 1 CsTPST基因的克隆与序列分析结果

PCR扩增及后续序列测定结果表明，CsTPST基因cDNA全长789 bp，编码262个氨基酸（图1-A）；DNA全长7561 bp。对其结构进行分析，结果表明，CsTPST基因拥有8个外显子和7个内含子（图1-B）。进化分析结果表明，CsTPST蛋白与甜瓜TPST蛋白的亲缘关系较近，其氨基酸序列相似性为93%，而与拟南芥TPST的亲缘关系较远，其氨基酸序列相似性为45%（图2）。

2. 2 CsTPST基因的组织表达分析结果

从图3-A可以看出，CsTPST基因在黄瓜的根和雌花组织中相对表达量显著高于叶片、雄花和茎（P<0.05，下同），分别为叶片中表达量的2.7和3.6倍；在茎和雄花中相对表达量显著低于叶片，分别为叶片中表达量的47%和53%。不同发育阶段及不同性型黄瓜材料基因表达分析结果表明，CsTPST基因在营养生长阶段（播种后30 d）的表达量显著高于生殖生长阶段（播种后50 d）；在雌性系材料中的表达量显著高于强雄系（图3-B）。植物激素与黄瓜性别关系密切，CsTPST基因在ACC处理的黄瓜叶片中上调表达量是CK的2.5倍，而在AVG处理的黄瓜叶片中下调表达量是CK的1/2。此外，CsTPST基因的表达不受IAA、GA3和CTK处理诱导（图3-C），说明CsTPST基因是一个受乙烯特定诱导表达的基因。

2. 3 CsTPST基因的启动子序列分析结果

从图4可以看出，CsTPST基因启动子中包含参与乙烯和铜反应的W-box、ERE和CuRE等元件。W-box参与了乙烯反应因子基因ERF3在植株遭受伤害后的起始表达（Nishiuchi et al.，2004）；ERE元件介导了乙烯诱导的U3启动子区域的转录起始活性（Itzhaki et al.，1994）；CuRE元件参与了铜反应因子转录起始活性的调控（Kropat et al.，2005）。

为了检测CsTPST基因启动子活性，本研究参考基因枪使用说明及有关资料，对洋葱表皮选择轰击条件为1100 psi×9 cm、过渡培养24～36 h、经暗培养后在解剖镜下观察（图5）。结果表明，CsTPST基因启动子激活了GFP基因的表达，即该基因启动子具有活性。

3 讨论

植物多肽是近年来发现对植物生长和发育具有重要调节作用的新型激素，目前已在植物中鉴定出多个编码植物多肽基因（Matsubayashi，2011， 2014），其中包括调控多肽发挥活性的TPST基因（Komori et al.，2009）。本研究通过生物信息学分析和同源克隆技术，从黄瓜叶片克隆得到CsTPST基因，并对其序列和表达进行分析，结果表明，CsTPST基因是一个乙烯诱导表达基因，与Wu等（2015）的研究结果相似。Wu等（2015）研究表明，PSK在乙烯生物合成途径中发挥负调控作用。随着植物体内乙烯含量的增加，为了保证植株正常生长发育，可能需要产生更多的活性PSK，进而对乙烯反应产生调控作用，而TPST基因的硫基化翻译后修饰是PSK发挥生物活性的前提，其表達受到乙烯的上调调控。也有研究结果表明，TPST和PSK与植物激素间有着密切的相互作用，如拟南芥TPST的表达会受到IAA处理的诱导（Zhou et al.，2010），BR对植物多肽PSK具有调节作用（Hartmann et al.，2013）。植物激素（尤其是乙烯）在黄瓜生长发育过程中发挥着重要的调控作用。

由于性型分化的多样性，黄瓜可作为研究植物性型分化的一个模式材料。目前已克隆获得的黄瓜雌性F基因（CsACS1G）和单性花决定M基因（CsACS2）均为乙烯合成酶基因（Mibus and Tatlioglu，2004；Li et al.，2009）。黄瓜是典型的利用雌性系进行杂交一代制种的园艺作物，对其性别决定及性型调控的分子机理进行研究将有助于精确控制黄瓜性型。本研究结果表明，CsTPST基因受到乙烯的诱导表达，暗示CsTPST或植物多肽PSK与乙烯生物合成有相互作用，可能也在黄瓜性别决定过程中发挥重要调控作用。这为深入研究CsTPST基因的生物学功能及黄瓜性别决定的分子机理提供了新思路。

4 结论

本研究结果表明，CsTSPT基因是一个受乙烯诱导表达的基因，可供开展CsTPST基因的生物学功能及性别决定的分子机理研究参考。

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（責任编辑 思利华）