提取净化方法对蔬菜中多菌灵残留测定影响的研究

潘小红，刘玉玲，周利平

（1.湖南省食品药品检验研究院，湖南长沙　410001；2.湖南省科技交流交易中心，湖南长沙　410001）



提取净化方法对蔬菜中多菌灵残留测定影响的研究

潘小红1，刘玉玲1，*周利平2

（1.湖南省食品药品检验研究院，湖南长沙410001；2.湖南省科技交流交易中心，湖南长沙410001）

摘要：采用高效液相色谱法测定多菌灵残留量，研究了液液萃取、固相萃取（手动）、固相萃取（自动）及快速溶剂-固相萃取4种不同提取净化方法在不同类别蔬菜中对多菌灵残留量测定的影响。结果发现，液液萃取的提取效果最低。新鲜蔬菜中，固相萃取（手动）、固相萃取（自动）及快速溶剂-固相萃取效果基本一致；干制蔬菜中，固相萃取的提取效果约为快速溶剂-固相萃取的90%～95%，2种方法准确性及检出浓度均能满足GB/T 23380—2009的要求。结果表明，固相萃取（手动）适用于新鲜蔬菜中多菌灵残留量的测定，干制蔬菜推荐用快速溶剂-固相萃取。该研究简化了新鲜蔬菜提取净化步骤，降低多菌灵残留测定成本，提高了检测效率。

关键词：多菌灵残留；蔬菜；固相萃取；快速溶剂萃取

多菌灵（Carbendazim）是一种常用的内吸性广谱杀菌剂，广泛应用于农作物防治工作中，其化学性质稳定，对人、畜均有一定毒性，因此有关多菌灵残留量的分析已经越来越受到重视[1-2]。

目前，国家及地方标准多菌灵残留测定中样品前处理的萃取及净化方法各不相同，《GB/T 20769—2008水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》采用Sep- Pak Vac柱及无水硫酸钠[3]、《GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌灵残留的测定高效液相色谱法》的快速溶剂萃取-固相萃取[4]、《NY/T 1453—2007蔬菜及水果中多菌灵等16种农药残留测定液相色谱-质谱-质谱联用法》的固相萃取[5]、《GB/T 5009.188—2003蔬菜、水果中甲基托布津、多菌灵的测定》的液液萃取法[6]。试验过程中发现，各种方法对不同类别蔬菜中多菌灵残留量的测定不完全适用，本研究采用高相液相色谱法检测多菌灵残留量，对比了液液萃取、固相萃取（手动）、固相萃取（自动）及快速溶剂-固相萃取在不同类别蔬菜中对多菌灵残留量测定的影响，提高前处理的专属性。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验原料

干品蔬菜（食用菌香菇、干辣椒）、新鲜蔬菜（萝卜、生菜、西红柿）均为超市购买，阳性样品（四季豆、香菇）为2015年国家餐饮风险监测样品。

1.1.2仪器与试剂

Ultimate 3000型高效液相色谱仪、DIONEX ASE 350型快速溶剂萃取仪，戴安公司产品；GX- 274型ASPEC全自动固相萃取仪，吉尔森公司产品；TB-215D型电子分析天平，DENVER公司产品。

乙腈、乙酸乙酯、甲醇为色谱纯，其余均为分析纯；多菌灵标准品，批号为90330，含量为99.5%，德国Dr.Ehrensorfer产品。

1.2试验方法

1.2.1色谱条件的选择

色谱柱，Thermo120°A（4.6mm×250mm，5μm）；流动相，流动相V（0.02 mol/L，pH值6.8磷酸盐缓冲液）+ V（乙腈）= 80+20；流速1.0 mL/min；检测波长286 nm；柱温30℃；进样量20 μL。

1.2.2多菌灵标准溶液的配制

精密称取多菌灵26.6 mg至100 mL容量瓶中，加甲醇溶至刻度，摇匀，用甲醇稀释0.053 2～26.6 μg/mL系列标准溶液。

1.2.3提取条件的选择

（1）液液萃取法。准确称取粉碎并混合均匀的样品（新鲜蔬菜25 g，干制蔬菜5 g）于50 mL离心管中，加入甲醇-冰醋酸样品液（配比为9∶1），振摇30 min，用石油醚振摇2次，每次25 mL，弃去石油醚，45℃水浴中减压浓缩近干，用5 mL流动相溶解，经0.45 μm滤膜过滤后，供液相色谱测定。

（2）固相萃取（SPE）法。分为全自动固相萃取及手动固相萃取。

准确称取粉碎并混合均匀的样品（新鲜蔬菜25 g，干制蔬菜5 g）于50 mL离心管中，加入50 mL甲醇-冰醋酸样品液（配比为9∶1），振摇30 min，取固相萃取小柱（OasisR MCX，150 mg/6 mL）依次用5 mL甲醇、5 mL超纯水进行活化。移取10 mL甲醇-冰醋酸样品，全部通过固相萃取小柱，弃去流出物。先后用5 mL超纯水、5 mL甲醇淋洗，抽干小柱，弃去流出物。再用5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，收集，氮吹仪上浓缩至干，用1 mL流动相溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。

（3）快速溶剂-固相萃取（ASE）法。准确称取粉碎并混合均匀的样品（新鲜蔬菜10 g，干制蔬菜5 g），加入适量硅藻土拌匀，上快速溶剂萃取仪，使用34 mL萃取池，温度100℃，压强13.80 MPa，加热5 min，以甲醇为溶剂静态萃取5 min，60%溶剂快速冲洗样品，60 s氮气吹扫，循环1次，收集全部提取液。45℃水浴中减压浓缩近干，加10 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液溶解，将上述溶液全部转移至活化后的固相萃取小柱，活化及萃取过程参照（2）固相萃取法。

1.2.4样品测定

采用1.2.2固相萃取法和快速溶剂-固相萃取法。

2　结果与分析

2.1回收率分析

从多菌灵的化学结构上看，是一种两性化合物。在中性和偏碱性水溶液中溶解度低，微溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂，能溶于无机酸和乙酸等。有机酸、碱性条件可增加多菌灵在有机溶剂中的溶解度，因此本试验固相萃取、液液萃取均采用甲醇冰醋酸为提取剂[7]。

分别在称好的5 g干品蔬菜（食用菌、干辣椒）、25 g新鲜蔬菜（萝卜、生菜、西红柿）添加3.2，14.0，21.2 μg多菌灵进行低、中、高回收率试验。

不同提取方式各种蔬菜的回收率见表1。

表1　不同提取方式各种蔬菜的回收率/ %

从表1可以看出，液液萃取的回收率介于78.3%～91.8%，固相萃取的回收率介于86.4%～100.2%，快速溶剂-固相萃取回收率介于85.4%～101.4%，固相萃取、快速溶剂-固相萃取回收率低、中、高3个浓度均高于液液萃取，固相萃取（手动）、固相萃取（全自动）、快速溶剂-固相萃取之间回收率无明显差异。

2.2阳性样品测定[8]

选用2015年国家餐饮风险监测的2批阳性样品（香菇、四季豆）进行残留量的测定。

阳性样品测定结果见表2。

表2　阳性样品测定结果/ mg·kg-1

从表2中可以看出，新鲜蔬菜（四季豆）阳性样品测定中，快速溶剂-固相萃取与固相萃取的结果均大于液液萃取，固相萃取自动与手动结果一致、快速溶剂-固相萃取与固相萃取的结果变化不大；干制蔬菜（香菇）阳性样品测定中，快速溶剂-固相萃取＞固相萃取＞液液萃取。

表1与表2的数据显示，样品加标回收率及阳性样品的测定，液液萃取效果均明显低于固相萃取与快速溶剂-固相萃取；加标回收率及新鲜蔬菜的阳性样品（四季豆）固相萃取与快速溶剂-固相萃取的测定结果基本一致，干制蔬菜阳性样品（香菇）中固相萃取测定结果低于快速溶剂-固相萃取。推测原因有3个：一是液液萃取是利用多菌灵在酸性甲醇及二氯甲烷中的不同溶解度进行分离，存在提取不够完全，回收率较低；二是加标回收是用多菌灵标准溶液直接添加至样品溶液中，阳性样品中的多菌灵残留在植物细胞内，因此阳性样品液液萃取的测定结果比其他3种提取方式的结果低；三是干制蔬菜相对新鲜蔬菜，其植物组织不易破坏，快速萃取仪有利于多菌灵残留的提取，增加了测定结果。

本研究选择新鲜蔬菜用固相萃取（手动）、干制蔬菜用快速溶剂-固相萃取测定多菌灵残留。

2.3样品测定及方法学考察

2.3.1线性方程考察

多菌灵标准色谱图及标准曲线见图1。

图1　多菌灵标准色谱图及标准曲线

结果表明，该方法在0.053 2～26.6 μg/mL范围内呈线性关系，其回归方程为Y=0.373 5X+0.461 7，R2=0.999 3。

2.3.2重现性考察

分别取新鲜蔬菜（四季豆）及干制蔬菜（香菇）各6份，采用固相萃取（手动）及快速溶剂-固相萃取测定。

固相萃取（手动）及快速溶剂-固相萃取方法重现性试验见表3。

表3　固相萃取（手动）及快速溶剂-固相萃取方法重现性试验

从表3中可以看出，采用固相萃取（手动）前处理的新鲜蔬菜（四季豆）及快速溶剂-固相萃取的干制蔬菜（香菇）重现性均较好，RSD分别为2.8%和2.5%。

多菌灵及四季豆阳性样品色谱见图2。

图2　多菌灵及四季豆阳性样品色谱

2.3.3检出限及定量限

本方法的检出限为0.105 ng，定量下限为0.309 ng。取5 g样品测定时，检出浓度为0.004 2 mg/kg，最低定量浓度为0.006 1 mg/kg，能够满足《GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌灵残留的测定高效液相色谱法》0.02 mg/kg的要求。

3　结论与讨论

本研究对比了液液萃取、固相萃取（手动）、固相萃取（自动）及快速溶剂-固相萃取4种不同前处理方式在不同类别蔬菜中对多菌灵残留量测定的影响，结果发现液液萃取效果最低，固相萃取（手动）与固相萃取（自动）效果相同；新鲜蔬菜中，固相萃取与快速溶剂-固相均可；干制蔬菜中，固相萃取的提取效果约为快速溶剂-固相萃取的90%～95%。固相萃取（手动）、快速溶剂-固相萃取均具有良好的重现性，能够满足《GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌灵残留的测定高效液相色谱法》的要求。

快速溶剂-固相萃取对辅助仪器的要求比较多，加速溶剂萃取仪（ASE）、固相萃取仪（SPE）购买及维护成本较高，在不少农药残留检测实验室中都没有配备，建议新鲜蔬菜中多菌灵残留量的测定采取固相萃取（手动）前处理方式，所用仪器、化学试剂都可获得，且成本低，可以准确测定新鲜蔬菜中多菌灵的残留量。

参考文献：

［1］吴剑威，金钺，杨美华，等.多菌灵分析方法研究进展及其在中药材中的应用［J］.中药材，2007，30（3）：363-367.

［2］郝金芝.高效液相色谱法测定水果中的多菌灵［J］.中国卫生检验杂志，2004，14（5）：586-587.

［3］中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局. GB/T 20769—2008水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法［S］.北京：中国标准出版社，2009.

［4］国家农副产品食品质量监督检验中心. GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌灵残留的测定高效液相色谱法［S］.北京：中国农业出版社，2009.

［5］农业部热带农产品质量监督检验测试中心. NY/T 1453—2007蔬菜及水果中多菌灵等16种农药残留测定液相色谱-质谱-质谱联用法［S］.北京：中国农业出版社，2008.

［6］卫生部食品卫生监督检验所. GB/T 5009.188—2003蔬菜、水果中甲基托布津、多菌灵的测定［S］.北京：中国标准出版社，2004.

［7］杨秀敏，陈永艳，胡彦学.固相微萃取-高效液相色谱-荧光检测法分析苹果汁中的多菌灵和噻菌灵［J］.中国食品学报，2007（7）：122-126.

［8］高国文，朱红霞.液相色谱法测定香菇中多菌灵农药残留方法研究［J］.农药科学与管理，2010，31（9）：36-38.

Study on the Effect of Extraction and Purification Method on the Determination of Carbendazim Residue in Vegetables

PAN Xiaohong1，LIU Yuling2，*ZHOU Liping2
（1. Hu'nan Provincial Food and Dung Inspction and Research Institute，Changsha，Hu'nan 410001，China；2. Hu'nan Science and Technology Exchange Center，Changsha，Hu'nan 410001，China）

Abstract：With high performance liquid phase chromatography determination of carbendazim residue，effects of four different extraction and purification methods of liquid- liquid extraction，SPE（manual），SPE（automatic）and FSE- SPE extraction are studied. Found that liquid- liquid extraction has lowest effect，SPE（manual & automatic），and FSE- SPE had the same effect in fresh vegetables，SPE（manual & automatic）is about 95%～90% of FSE in dry vegetables，and accuracy of these two methods are can meet the requirements of GB/T 23380—2009. The results show that SPE（manual）is applicable for the determination of carbendazim residues in fresh vegetables and FSE- SPE extraction is recommended to dry vegetables. This study simplifies the extract purification step，cut cost and improve the detection efficiency on the determination of carbendazim residue in fresh vegetables.

Key words：carbendazim residue；vegetables；solid phase extraction（SPE）；fast solvent extraction（FSE）

作者简介：潘小红（1983—），女，硕士，助理研究员，研究方向为食品与保健食品及化妆品的检验和研发。*通讯作者：周利平（1965—），女，博士，副研究员，研究方向为科技成果推广、产业技术转移和科技金融。

收稿日期：2016- 01- 22

文章编号：1671- 9646（2016）03b- 0054- 04

中图分类号：TS255.7

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.042