盐酸小檗碱在黄连水煎液中的生物药剂学分类系统属性研究

隗丽　朱美玲　董月柳　董玲　刘洋　陈江鹏　尹秀文

[摘要]中药生物药剂学分类系统的基础研究之一是在多成分环境下对单一成分进行研究，即除成分自身溶解性和渗透性外，需结合多成分环境下造成的溶解性和渗透性各自提升度进行分类研究。该研究以小檗碱为主要研究对象，探究其在黄连水煎液中的水溶解性及肠渗透性变化规律。其中采用经典摇瓶法和高效液相色谱法测定小檗碱在不同pH缓冲液及不同浓度的黄连水煎液中的溶解度，并分别采用在体单向灌流模型及肠道灌流并行采血模型进行小檗碱的肠吸收和入血吸收的研究。

[关键词]黄连；小檗碱；溶解性；肠渗透性；中药生物药剂学分类系统

[Abstract]The study of single component in the multicomponent environment is one of the basic researches for biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica （CMMBCS） That is to say， the classification research shall be based on the respective lift of solubility and permeability in the multicomponent environment， besides solubility and intestinal permeability of the single component We chose berberine as the main research object to investigate the changes of its solubility and intestinal permeability in Huanglian decoction Shakeflask and HPLC were used to detect the solubility of berberine in different pH buffer solutions and different concentrations of Huanglian decoction In situ singlepass intestinal perfusion （SPIP） and intestinal perfusion with venous sampling （IPVS） were carried out to study berberine′s intestinal absorption and absorption into blood， respectively

[Key words]Coptidis Rhizoma； berberine； solubility； intestinal permeability； biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica

doi：10.4268/cjcmm20160706

口服药物的水溶解性及肠渗透性是影响其胃肠道吸收的2个重要参数。生物药剂学分类系统（BCS）据此对药物进行科学分类，确定药物吸收过程中的限速过程，针对此进行合理的设计以获得安全、有效的药品[12]。目前BCS仍然在不断地完善和发展，也衍生出了其他以不同侧重点进行研究的分类系统[46]。但BCS针对的是单一成分的化学药品，对于中药多成分复杂体系而言并不适用，结合中药自身特点与生物药剂学分类系统的优势，本课题组提出了中药生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）[7]。基于“多成分层次差异比较法”的理论指导，课题组前期研究了模拟多成分环境对葛根素（葛根芩连方中君药主要成分）的溶解性及渗透性的影响[89]，本研究旨在探究单一成分在药材水煎液这一真实的多成分环境中的BCS属性变化规律。黄连为葛根芩连方中的臣药，具有抗菌、抗病毒、降血脂、降血糖等药理作用[1011]，小檗碱为其主要活性成分，与黄连碱、巴马汀及药根碱的含量约占黄连总生物碱的95%，其中小檗碱约占50% [12]。因此，本研究选择小檗碱为主要研究对象，探究其在黄连水煎液中的水溶解性及肠渗透性变化规律，以丰富中药生物药剂学分类系统的研究，并为其进一步发展提供数据支持及研究基础。

1 材料

11仪器

LC20AT高效液相色谱仪（SPD20A型紫外检测器，SIL20A自动进样器，日本岛津公司）；BT25S电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；DZKW4电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；KH7200DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；STARTER 2100实验室pH计（奥豪斯仪器上海有限公司）；蠕动泵（BT1001F，保定兰格恒流泵有限公司）；注射泵（LSP021B，保定兰格恒流泵有限公司）；高速冷冻离心机（SIGMA，德国）。

12药物与试剂

盐酸小檗碱对照品（批号110713201212，中国食品药品检定研究院）；盐酸小檗碱原料（批号130808，陕西中鑫生物技术有限公司）；乙腈（色谱级，美国Fisher公司）；黄连饮片购于北京同仁堂药店。水合氯醛、氯化钠注射液、磷酸、氯化钠、氯化镁、氯化钾、磷酸二氢钠、氢氧化钠、葡萄糖、三乙胺、碳酸氢钠、氯化钙（AR，北京化工厂）；纯净水（娃哈哈集团公司）。

13动物

SD大鼠，雄性，体重200～250 g，北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）20140004。

2方法

21供试液的配制

KrebsRinger′s营养液（KR液）：称取NaCl 780 g，KCl 035 g，CaCl2 037 g，NaHCO3 137 g，NaH2PO4 032 g，MgCl2002 g，葡萄糖140 g，加蒸馏水定容至1 L，调节pH到739～741，放置备用。

黄连水煎液的制备：取适量黄连药材加10倍量水，常温浸泡30 min，煎煮保持微沸30 min，趁热滤过；药渣加8倍量的水煎煮保持微沸30 min，趁热抽滤，合并2次滤液，浓缩，冷至常温，加水定容得黄连水煎液，相当于生药质量浓度60 g·L-1，备用。

灌流液制备：取黄连水煎液用KR液稀释至生药质量浓度为3，12，30 g·L-1灌流液。

22不同pH缓冲液的配制

pH 10盐酸溶液：量取盐酸溶液9 mL，加水稀释至1 L，调节pH至10，即得。pH 25缓冲液：取磷酸二氢钾100 g，加水800 mL，用盐酸调节pH至25，用水稀释至1 L，调节pH至25，即得。pH 40缓冲液：取一水枸橼酸1290 g，磷酸氢二钠2725 g，加水1 L溶解，调节pH至40，即得。pH 68缓冲液：取磷酸二氢钾170 g和磷酸氢二钾178 g，加水溶解稀释至1 L，调节pH至68，即得。pH 70缓冲液：取02 mol ·L-1磷酸二氢钾溶液250 mL和02 mol ·L-1氢氧化钠溶液1455 mL混合，加水稀释至1 L，调节pH至70，即得。pH 74缓冲液：取磷酸二氢钾681 g，加01 mol ·L-1氢氧化钠溶液395 mL稀释至1 L，调节pH至74，即得。

23盐酸小檗碱含量测定方法

231色谱条件采用Luna C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm，Phenomenex，USA），检测波长270 nm，流速10 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量20 μL，流动相水（04%磷酸，08%三乙胺）乙腈，梯度洗脱（0～11 min，87∶13～87∶13；11～12 min，87∶13～83∶17；12～17 min，83∶17～83∶17；17～26 min，83∶17～76∶24；26～385 min，76∶24～71∶29；385～45 min，71∶29～68∶32；45～65 min，68∶32～32∶68；65～75 min，32∶68～87∶13）。

232标准曲线制备精密量取小檗碱对照品贮备液（10 g·L-1）配制质量浓度分别为0200 4，0400 8，2004，1002，2004，4008，8016，12024 mg·L-1的对照品溶液，精密取上述对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以药物质量浓度C（mg·L-1）为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。

233精密度试验取含药灌流液于1 d内HPLC重复测定6次，测定峰面积。

234稳定性试验含药灌流液于0，2，4，6，12，24 h取样检测，测定峰面积。

235回收率考察精密吸取高、中、低3个浓度含药灌流液，每个浓度平行3份，各精密加入对照品灌流液，测定峰面积，以测得浓度与实际浓度做比较计算方法回收率。

24盐酸小檗碱在不同环境中溶解度的测定

241盐酸小檗碱在不同pH缓冲液中溶解度的测定称取待测小檗碱原料药适量，置25 mL具塞试管中，加入不同pH缓冲液10 mL，37 ℃水浴加热，每隔5 min振摇30 s，观察30 min，直至待测物不再溶解，得到饱和溶液。取出室温静置10 min后，过045 μm微孔滤膜过滤，得续滤液。加入相应的缓冲液稀释至一定浓度，摇匀过滤，高效液相色谱法测定其平衡溶解度。

242黄连水煎液中盐酸小檗碱在pH 74缓冲液中溶解度的测定分别取不同生药质量浓度（3，12，30 g·L-1，调pH至74）的黄连水煎液各10 mL，置25 mL具塞试管中，加入小檗碱原料药200 mg，（37±1） ℃水浴加热，每隔5 min振摇30 s，观察30 min，直至待测物不再溶解，得到饱和溶液。室温条件下静置10 min，过045 μm微孔滤膜过滤，得续滤液，分别加入pH 74缓冲液稀释至一定浓度，高效液相色谱法测定其平衡溶解度。

25大鼠在体肠吸收实验方法

251大鼠在体单向肠灌流实验大鼠禁食不禁水18 h，称重，10%水合氯醛麻醉，沿腹中线剪开腹部3～4 cm，分离实验用肠段，各肠段取约10 cm，肠段进口端与注射泵相连，用预热至37 ℃的生理盐水以5 mL·min-1的速度对所取肠道进行冲洗。流速调为02 mL·min-1灌流药液，约30 min后吸收达到稳定状态。开始计时，用已知质量的小瓶在出口处每隔15 min收集一次，计算收集前后小瓶质量称量差，同时测定收集液的密度，以此方法对灌流液的体积校正。实验结束后处死大鼠并剪下被灌流的肠段，测量其长度和内径。按231项下色谱条件测定不同时间段流出药液中盐酸小檗碱含量。

252大鼠肠道灌流并行采血实验大鼠禁食不禁水18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，右侧颈静脉插管连接到蠕动泵进行供血。打开腹部，选取肠段，用37 ℃的生理盐水冲洗干净，结扎实验用肠段以外的血管。对所取灌流肠段对应的肠系膜静脉插管，并连接到蠕动泵，收集肠系膜静脉流出血液。肠段进口端与注射泵相连，将注射泵流速调为02 mL·min-1，灌流药液，约30 min后吸收达到稳定状态。开始计时收集流出的药液和血液。每隔15 min更换肠液和血液的收集管。采用质量法进行水分校正。试验结束后，用生理盐水冲洗肠段，将所用肠段剪下，测量其长度和内径，并处死大鼠。所取血液样品3 500 r·min-1离心15 min，取上层血浆，加入3倍量的甲醇沉淀蛋白，涡旋2 min，1万 r·min-1离心15 min，取上清液定容至5 mL，经045 μm微孔滤膜过滤，取续滤液注入高效液相色谱仪进行检测；灌流液样品经045 μm的微孔滤膜过滤，注入高效液相色谱仪进行检测。

253数据分析[13]在体大鼠单向灌流中采用重量法校正水分吸收，计算有效渗透系数Peff、肠吸收速率常数Ka和肠吸收分数Fa。

Peff=-Qin·ln[Cout（cor）/Cin]2πrL

Ka=（1-Cout（cor）Cin）QinV

Fa=（1-Cout（cor）Cin）×100%

Cout（cor）=CoutQoutQin

Qout=Mout/Doutt

式中Qin是灌流液流速（mL·min-1），L是灌流肠段长度（cm）；r是灌流肠段半径（cm）；Cin是灌流液中盐酸小檗碱初始质量浓度（mg·L-1）；Cout（cor）是经重量法校正后的灌流收集液中盐酸小檗碱质量浓度（mg·L-1）；V=πr2L是灌流肠道体积（mL）；Qout是通过灌流液流出的速度（mL·min-1）；Cout是灌流收集液中盐酸小檗碱质量浓度（mg·L-1）；Mout是灌流收集液质量（g），Dout是灌流收集液密度（g·mL-1），t是取样周期（min）。

肠道灌流并行采血实验采用重量法校正水分吸收，计算有效渗透系数Pblood。

Pblood=ΔMB/Δt2πrL·

=Cout（cor）-C0ln[Cout（cor）/C0]

式中ΔMB/Δt是血液样品中盐酸小檗碱物质的量（μg·sec-1）；是灌流肠段内盐酸小檗碱对数平均质量浓度（mg·L-1）；L是灌流肠段长度（cm）；r是灌流肠段半径（cm）；Cout（cor）是盐酸小檗碱校正后灌流收集液质量浓度（mg·L-1），C0是盐酸小檗碱初始灌流液质量浓度（mg·L-1）。

3结果

31药物浓度的测定

分别取空白灌流液、对照品溶液、含药灌流液、空白血浆及含药血浆进行液相检测，考察该色谱条件下空白灌流液及空白血浆对样品含量测定的干扰。结果见图1，空白灌流液及空白血浆在231项下色谱条件对药物测定无干扰，说明该方法专属性良好。盐酸小檗碱的线性回归方程为Y=95 717X-8 5529，R2=0999 1，结果表明，小檗碱在0200 4～12024 mg·L-1线性关系良好。本方法测定的精密度及稳定性实验RSD均小于10%。加样回收率9987%～1029%，RSD均小于50%。

322黄连水煎液中小檗碱的溶解度小檗碱在不同质量浓度黄连水煎液（生药质量浓度为3，12，30 g·L-1）中的溶解度测定结果见表1。小檗碱溶解度随着黄连生药浓度的增大而增大，在中、高浓度时比单一小檗碱溶解度要高。在低浓度时溶解度较单一成分比减小，推测黄连水煎液中可能存在某些成分在低浓度时对小檗碱的溶解度为抑制作用，高浓度时为促进作用。

33盐酸小檗碱在不同环境中的渗透性测定

331小檗碱单体在不同的浓度和肠段中吸收参数不同质量浓度小檗碱灌流液（40，80，120 mg·L-1）在各个肠段间的吸收参数见表2。小檗碱在不同肠段单灌流的渗透系数Peff均<5×10-5 cm·s-1，为低渗透性的药物。小檗碱的肠吸收速率常数的数量级在1×10-4级别，回肠、结肠吸收速率常数较低。空肠吸收分数最高，结肠吸收分数最低。由此可见，小檗碱在小肠上端吸收较好，中、高浓度比低浓度吸收好，大鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠在高中低浓度下吸收速率参数（Ka）无显著性差异，提示药物的吸收机制可能为被动扩散。小檗碱在不同肠段吸收分数都较低，约在4%左右。

332黄连水煎液中小檗碱在不同的浓度和肠段中吸收参数根据小檗碱在体单向灌流实验结果，选择大鼠空肠段进行不同浓度的黄连水煎液的在体单向灌流实验及肠道血管并行采血实验，结果见表3。黄连水煎液（3 g·L-1）中小檗碱质量浓度与小檗碱单一成分（80 mg·L-1）质量浓度相当时，黄连水煎液中小檗碱的肠吸收参数Peff和Ka均显著增加（P<005），且水煎液中小檗碱的吸收速率随着生药浓度的增加而增大。同时，黄连水煎液（3 g·L-1）的吸收入血渗透系数较单一成分而言有所增大，而高浓度黄连水煎液Pblood相比较于单一小檗碱的Pblood发生了数量级的变化。

4讨论

鉴于生物药剂学分类系统的科学性及实用性，FDA，EMA及WHO将其引入到指导原则中进行药物生物等效性豁免的评价研究，但是其在中药相关领域的研究甚少。中药的多成分及多成分的体内相互作用等使得分类研究十分困难，有研究[15]对中药中已明确的化学成分对照品进行临时的生物药剂学分类，为确保药品的质量提供有力的保证，但该研究并未真正将中药的多成分环境纳入到分类研究的考虑之中。中药的本质属性为多成分之间共同作用发挥疗效，中药中的成分均处于受其他各种成分构成的多成分环境的影响中，成分之间的影响可能会使得中药成分乃至中药整体的水溶解性与肠渗透性发生变化，而这种变化是可测的。

本研究中由小檗碱单一成分的实验结果可知，其溶解性和渗透性均较低，为BCS第Ⅳ类药物，依据CMMBCS分类标准，初步定为CMMBCSⅣ类，即自身溶解性和渗透性均较差的药物。而黄连水煎液中小檗碱的BCS属性溶解性和渗透性相比较于单一小檗碱有所不同。小檗碱的溶解度随着黄连水煎液生药浓度的增加而增大，表明了药材浓度的增大有利于小檗碱溶解度的增加。在体单向肠灌流实验结果显示黄连水煎液中小檗碱的吸收速率随着生药浓度的增加而增大，也表明小檗碱存在被动转运机制。且黄连水煎液中小檗碱能通过肠壁吸收进入血液，从高浓度黄连水煎液的Pblood结果看出，吸收入血量明显增大，且发生了数量级的变化。黄连水煎液（3 g·L-1）中小檗碱的渗透性大于小檗碱单一成分（80 mg·L-1），吸收入血的渗透性也大于小檗碱单一成分。说明小檗碱在单个药材中比单一成分更有利于其吸收。虽然黄连水煎液中小檗碱溶解性和渗透性有所改变，但提升不高，初步定为自身于溶解性和渗透性差且在单个药材环境下提升不高的CMMBCSⅣ类。

对于中药生物药剂学分类系统研究而言，需要从单一成分研究上升到中药多成分甚至中药整体研究，本研究则以小檗碱单一成分的水溶解性及肠渗透性为研究基础，进一步研究了其在中药多成分环境中的变化规律。但对整体研究而言，不仅化学成分众多，而且所含大部分成分的药理作用也未能一一阐释清楚，除此之外，大多数中药在使用过程中用量并不十分明确，对中药整体进行生物药剂学分类需考虑其他成分对每一成分的影响。

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[责任编辑孔晶晶]