羽叶丁香茎皮中环烯醚萜类成分

陈苏依勒　苏国柱　白睿峰　尹旭　曹愿　屠鹏飞　柴兴云

[摘要]通过色谱方法从蒙药特色药材山沉香原植物羽叶丁香的茎皮中分到1个新的和5个已知的环烯醚萜，其结构经质谱，核磁共振谱等分析，及与文献数据相比对鉴定。化合物1命名为山沉香萜苷A（alashanidoid A）。5个已知成分分别为（8E）女贞子苷（2），异女贞苷（3），3′OβD葡萄糖女贞苷（4），10羟基女贞苷（5），木犀榄苷二甲酯（6），其中3～5为丁香属内首次报道，2和6为本种内首次报道。化合物1～6抑制RAW2647细胞中NO生成和HepG2细胞毒的活性筛选，但不显示明显的抑制活性。

[关键词]山沉香；蒙药；环烯醚萜；山沉香萜苷A

[Abstract]One new iridoid， named alashanidoid A， and five known analogues， were isolated from the stem bark of Syringa pinnatifolia by various chromatographic methods Their structures were determined on the basis of MS and NMR spectroscopic data analyses， and comparison with those in literature Among them， compounds 35 were isolated from this genus for the first time， and 2 and 6 were isolated from the species for the first timeThese isolates were tested for their in vitro antiinflammatory activities against NO production in lipopolysaccharide（LPS）induced RAW2647 macrophages in mice and cytotoxicity of HepG2 cell line， however， no obvious activity was observed at the concentration of 40 μmol·L-1

[Key words]Syringa pinnatifolia； Mongolian folk medicine； iridoid； alashanidoid A

doi：10.4268/cjcmm20160715

羽叶丁香Syringa pinnatifolia Hemsl又名贺兰山丁香，为木犀科Oleaceae丁香属植物，是我国丁香属特有品种，主要分布在我国内蒙、宁夏、甘肃、青海、陕西、四川等地，其中以内蒙和宁夏交界的贺兰山地区较为集中[1]。羽叶丁香去皮的根、根茎及粗枝，是一种特色蒙药材——山沉香，蒙药名“阿拉善·阿嘎如”，具有抑赫依、清热、止痛等功效，主治心、胸、血性等刺痛、赫依性心激荡、气急、主脉赫依病等，蒙医用其治疗胸闷气短、心肌缺血等心肺疾病，疗效显著[1]。

为进一步阐明山沉香抗心肌缺血的药效物质基础和充分利用这一宝贵的蒙药资源，本课题组采用C57BL/6小鼠左冠状动脉结扎法评价其抗心肌缺血效果，发现山沉香乙醇提取物具有显著的保护缺血性心肌损伤的作用[2]。同时对不纳入药用的茎皮进行化学研究，以期为山沉香药效部位的化学表征提供对照品。采用正、反相硅胶和Sephadex LH20等色谱技术从山沉香茎皮中分离鉴定了6个环烯醚萜类成分，其结构经波谱技术及与文献数据比较鉴定，包括1个新的环烯醚萜， 定名为山沉香萜苷A（alashanidoid A，1），和5个已知类似物（8E）女贞子苷（2） [3]，异女贞苷（3） [4]，3′OβD葡萄糖女贞苷（4） [5]，10羟基女贞苷（5） [6]，木犀榄苷二甲酯（6） [78]，化合物3～5为丁香属内首次报道，2和6为本种内首次报道。

1材料

Varian Inova500型核磁共振仪；日本岛津高效液相离子阱飞行时间质谱仪；美国鲁道夫Autopol IV旋光仪；Sephadex LH20（瑞典Amershan Biosciences）；Waters 2535制备液相（美国Waters）；半制备色谱柱Shimpack PREPODS（H） C18（20 mm×250 mm，5 μm）。ODS（40～63 μm，德国Merck）；柱色谱用硅胶（200～300目）及薄层色谱用GF254硅胶预制板，均为青岛海洋化工厂生产；提取和分离中所用化学试剂均为分析纯（北京化工厂）；纤维素酶为北京生物技术有限公司产品；SANYO MCO18AIC细胞培养箱；Motic AE2000倒置荧光显微镜；ESCO OptiMair超净工作台；瑞士TECAN M1000型多功能酶标仪；DMEM培养基（Hyclone，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；一氧化氮检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；阳性对照为槲皮素为美国Sigma公司产品。

腹腔巨噬细胞RAW 2647和肝癌细胞HepG2购自上海细胞所。

羽叶丁香2013年7月采自内蒙古阿拉善贺兰山地区，经阿拉善盟蒙医医院陈苏依勒鉴定为S pinnatifolia，异名贺兰山丁香S pinnatifolia var alashanensis YC Ma & SQ Zhou[1]，剥取茎皮，阴凉处干燥，凭证标本存放于北京中医药大学中药现代研究中心（SP201307B）。

2提取与分离

山沉香茎皮（13 kg），依次用95%和80%的乙醇回流提取2次，每次25 L，提取15 h。提取液减压浓缩得浸膏325 g。采用正相硅胶柱色谱，依次用氯仿甲醇（20∶1～0∶1）洗脱得到9个流分（A～I）。E（106 g）和F（82 g）合并采用正相硅胶柱色谱，以乙酸乙酯甲醇（10∶1～0∶1）洗脱得到8个流分（EF1～EF8）。EF1（12 g）经反相硅胶分离甲醇水（1∶2～1∶0）洗脱，Sephadex LH20柱色谱甲醇洗脱、纯化得到化合物3（35 mg）和4（65 mg），其余部分通过HPLC制备液相（30 mL·min-1，乙腈水18∶82）得到化合物1（tR=245 min，65 mg）和6（tR=273 min，102 mg）。EF3（25 g）经HPLC制备液相（甲醇水，40∶60）纯化得到化合物2（tR=333 min，5005 mg）和5（tR=435 min，2001 mg）。化合物1～6结构式见图1。

3抗炎和肝癌细胞毒筛选

取对数生长期的RAW2647细胞，按每孔2×105个细胞数接种于96孔板中，24 h后加入50 μL不同浓度的单体化合物，2 h后加 50 μL LPS（1 mg·L-1）刺激24 h，加MTT，孵育4 h，570 nm下测细胞A，以630 nm作为校正波长。取细胞上清 50 μL，采用Griess法测定一氧化氮（NO）的含量。取对数生长期的HepG2细胞，按5×104细胞数接种于96孔中，孵育24 h贴壁后加入100 μL不同浓度的单体化合物，培养24 h，加MTT，孵育4 h，570 nm下测细胞A，以 630 nm作为校正波长。抑制率按照下式计算：抑制率=（A模型-A给药） / A模型×100%。

4结构鉴定

化合物1褐色糖浆状，[α]25D-974（c 01，MeOH）；UV（MeOH）λmax（logε） ：277（308）， 226（396）， 202（384） nm；IR（KBr）vmax：3 132， 1 630， 1 516，1 400， 1 309， 1 158， 1 078 cm-1；HRESIMS m/z 709232 6 [M +Na]+（计算相对分子质量709232 4 ， C31H42O17Na），结合其核磁数据确定分子式为C31H42O17，不饱和度11。

1HNMR（CD3OD，500 MHz）数据见表1，结合HSQC图谱分析显示，化合物1中含有AA′BB′型芳香质子[δH 705（2H，d，J=80 Hz，H2″，6″），668（2H，d，J=80 Hz，H3″，5″）]，2个烯质子δH 751（1H，br s，H3），610（1H，br q，J=70 Hz，H8），1个甲氧基δH 371（3H，s）和1个甲基δH176（3H，d，J=70 Hz），2个端基质子δH 479（1H，d，J=75 Hz，H1′），δH 435（1H，d，J=80 Hz，H1）及糖上其他质子信号。13CNMR（CD3OD，125 MHz）见表2，显示31个碳信号，包括2个酯羰基δC 1729（C7）和1689（C11），4个季碳δC 1568（C4″），1306（C1″），1305（C9），1093（C4），2个烯碳δC 1553（C3），1251（C8），4个芳香碳δC 1309×2，1161×2，1个连氧碳δC 722（Cα），3个饱和碳δC 363（Cβ），316（C5），407（C6），1个甲氧基δC 519，1个甲基δC 137，以及2组糖上碳信号。上述归属并结合详细的HMBC分析可以明确化合物1中含有1个对羟基苯乙醇片段，而且由H1到Cα的HMBC相关显示苯乙醇片段与其中1个糖相连。其他除糖之外的NMR数据分析可以判断分子中存在一个环烯醚萜结构，详细的HMBC关系见图1。另一个糖端基信号H1′与C1相关，提示环烯醚萜在C1位成苷。上述分析显示，化合物1与已知化合物（8E）女贞子苷（2）[3]和异女贞苷（3）[4]结构非常近似。详细比较其13CNMR数据发现，除C2[ΔδC-（ 14～19 ）]，C3[ΔδC +（15～34） ]，C4[ΔδC-（08～32） ]，C5[ΔδC +（19～26 ）]的化学位移发生了一定变化外，其他位置数据基本保持一致，基于糖基酯化对相邻碳化学位移的影响，并与文献中itosides C和F[9]中相似的变化规律相符，最终确定C3位与C7酯羰基相连，确定了化合物1结构各片段的连接顺序。糖的类型经酶水解后分析确定，具体操作如下：将DMSO溶解的化合物1（095 mg）与等质量的纤维素酶一同加入乙酸乙酸钠缓冲盐溶液中（pH 45，20 mL）。混合溶液在温度40 ℃静置12 h后与等体积的乙酸乙酯混合，萃取，振摇，取下层水液浓缩、与葡萄糖标准品TLC及旋光数据比对，鉴定为βD葡萄糖。上层溶液浓缩后，通过LCMS分析确定对羟基苯乙醇和环烯醚萜苷元。

在ROSEY谱中可以看到H1与H6相关，表明H1与H5异面；H10与H5相关可判断双键构型为E构型，进一步结合旋光数据及与文献比对[3]，确定化合物1的相对构型分别为H1α和H5β，最终鉴定了化合物1的结构，经SciFinder数据库检索为一未知结构，定名为山沉香萜苷A（alashanidoid A）。

化合物2白色粉末，[α]25D-1023（c 017，MeOH）；HRESIMS m/z 685232 1[M-H]-，分子式C31H42O17，1H和13CNMR数据分别见表1，2。以上数据与文献[3]报道一致，故鉴定为（8E）女贞子苷[（8E）nüzhenide]。

化合物3黄色粉末，[α]25D-916（c 002，MeOH）；HRESIMS m/z 685232 1[M-H]-，分子式C31H42O17，1H和13CNMR数据分别见表1，2。以上数据与文献[4]报道一致，故鉴定为异女贞苷（isonüezhenide）。

化合物4白色粉末，[α]25D-720（c 01，MeOH）；HRESIMS m/z 685231 2[M-H]-，分子式C31H42O17，1H和13CNMR数据分别见表1，2。以上数据与文献[5]报道一致，故鉴定为3′OβD葡萄糖女贞苷（3′OβDglucopyranosylligustroside）。

化合物5黄色糖浆状，[α]25D-1360（c 007，MeOH）；HRESIMS m/z 563163 8[M + Na]+，分子式C25H32O13，1H和13CNMR数据分别见表1，2。以上数据与文献[6]报道一致，故鉴定为10羟基女贞苷（10hydroxyligustroside）。

化合物6黄色糖浆状，[α]25D-1840（c 0082，MeOH）；HRESIMS m/z 463145 2 [M + HCOO]-，分子式为C18H26O11，1H和13CNMR数据分别见表1，2。以上数据与文献[78]报道一致，故鉴定为木犀榄苷二甲酯（oleoside dimethyl ester）。

化合物1～6在40 μmol·L-1浓度对LPS诱导RAW2647细胞NO生成（槲皮素为阳性对照）和HepG2细胞毒均不显示抑制作用。

5结果与讨论

丁香属植物的化学成分主要为环烯醚萜类、木脂素类、苯乙醇及苯丙素类[10]，而羽叶丁香去皮的茎和根中的主要成分为木脂素[1]，此前一直没有环烯醚萜的报道。本研究首次对羽叶丁香茎皮进行了化学成分研究，从中分离鉴定6个环烯醚萜类，包括1个新的和5个已知类似物。研究结果既为羽叶丁香与同属其他植物的分类学提供了化学分类依据，也在一定程度上证明了环烯醚萜类极少产生于羽叶丁香的茎木，而更多在树皮或叶中，这或许与植物利用此类物质防御蚂蚁侵袭等生态学功能相关[11]，同时也暗示环烯醚萜类成分不是山沉香抗心肌缺血的药效物质。

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[责任编辑丁广治]