陕西省地方酸奶中乳酸菌的分离鉴定及耐药性分析

梁宁利，巨亚杰，冯艳芸，巩蓬勃

（宝鸡出入境检验检疫局，陕西宝鸡　721006）



陕西省地方酸奶中乳酸菌的分离鉴定及耐药性分析

梁宁利，巨亚杰，冯艳芸，巩蓬勃

（宝鸡出入境检验检疫局，陕西宝鸡721006）

摘要：从5种陕西省市售地方酸奶中分离出乳酸菌，研究乳酸菌分离株对多西环素、万古霉素、头孢吡肟、庆大霉素、四环素、链霉素以及红霉素这7种抗生素的耐药性。利用MRS培养基和MC培养基，通过划线分离培养分离酸奶样品中的乳酸菌，对分离株进行甲苯胺蓝染色初级鉴定，同时采用纸片扩散法进行耐药性对比。从5种品牌酸奶中共分离出5株菌株，包括杆菌4株、球菌1株，用纸片扩散法进行耐药性测定均没有检测到获得性耐药表型。

关键词：保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；分离；耐药性

0　引言

酸奶是以鲜奶为原料，经过巴氏杀菌后添加发酵剂发酵后，再冷却灌装的一种发酵乳制品。乳酸菌作为主要发酵剂，因其良好的发酵性能和益生功效在发酵食品行业中占有不可替代的位置。乳酸菌是指发酵糖类，主要代谢产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称[1]。乳酸菌有较长的安全使用历史，长期以来发酵产品中所使用的乳酸菌普遍被人们认为是安全（Generally regarded as safe，GRAS）菌株，并且它还与人以及动物肠道内生微生物群落存在着相互作用，产生益生作用，有益于人和动物的健康[2]。2002年，国际乳业联合会公布的在发酵乳制品中有长期安全使用历史的微生物名单中细菌有18个属81个种，其中乳杆菌有36个种、双歧杆菌有8个种[3]。德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌是目前制作酸奶的主要发酵剂，所有酸奶的标签上都标注有这2种乳酸菌。

近几十年来，抗生素在医疗、兽医以及动物饲料等行业得到了广泛应用，甚至出现了滥用现象，导致微生物耐药问题日趋严重，使人们在应对细菌感染疾病时将面临前所未有的挑战[4]。早期有关细菌耐药的研究主要集中在病原微生物的研究上，但是近些年对于环境中的共生细菌以及以乳酸菌为代表的益生菌耐药的关注越来越多[5-6]。在研究初期，学者们认为，乳酸菌的耐药对其定植于人类或动物肠道内发挥益生功效有一定的帮助，但随后越来越多的报道显示乳酸菌的耐药机制与许多病原菌的耐药机制十分相似。已有报道称某些乳酸菌携带耐药基因且具有相应的耐药表型[7]，如Mathur，Hummel以及Cataloluk等人就在发酵食品中检测到红霉素和四环素的耐药基因[2，5，8]；在生产酸奶用的乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的某些菌株中也检测到一些耐药基因[5]。这些乳酸菌作为益生菌在进入人体后（尤其是肠道），有将耐药基因水平传播给体内的其他细菌，包括条件致病菌和致病菌的可能性[9]，从而对人类健康产生潜在的威胁。因此，是否具有耐药性或携带耐药基因已经成为评价益生菌安全与否的重要标准之一[10]。

近年来，国内外越来越多的研究表明，长期以来被认为安全的、广泛应用于发酵食品领域的乳酸菌已经产生耐药并携带了相应的耐药基因。因此，通过研究陕西地区市售酸奶样品中乳酸菌，对7种具有代表性奶牛常用抗生素的耐药性进行对比，为评价酸奶中乳酸菌菌株的安全性及筛选安全菌株提供一定的参考依据。

1试验材料与试剂

1.1试验材料

5种陕西地方市售酸奶，购自宝鸡人人乐超市，分别为A，B，C，D，E品牌。

1.2试验试剂

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、柠檬酸二胺、乙酸钠、葡萄糖、吐温- 80、琼脂、碳酸钙、醋酸、大豆蛋白胨、乳糖、中性红、蒸馏水、氯化钠、甲苯胺蓝，以及K2HPO4，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O均为市售分析纯。

1.3试验仪器

恒温培养箱，上海一恒科技有限公司产品；高压灭菌锅，日本ALP公司产品；PHS- 3C型pH计，上海仪电分析仪器有限公司产品；双人单面超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；UX6200H型分析天平，北京赛多利斯仪器系列有限公司产品。

2试验方法

2.1培养基的配制

（1）MRS琼脂培养基的配制。①材料：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO42 g，柠檬酸二胺2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温- 80 1 mL，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，MgSO4· 7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g。②制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH值6.2～6.4，分装于三角瓶中，于121℃下高压灭菌21 min。将MRS培养基用醋酸调节pH值至5.4，制成酸化MRS培养基，将MRS培养基除去琼脂，制得液态MRS培养基。

（2）改良MC培养基的配制。①材料：大豆蛋白胨5.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，乳糖20.0 g，碳酸钙10.0 g，琼脂15.0 g，中性红0.05 g。②制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调节pH值至6.0左右，于121℃条件下灭菌20 min。

2.2酸奶梯度稀释

吸取1 mL酸奶于9 mL的生理盐水中混匀，此为1×10-1稀释液；再取1×10-1稀释液1 mL于9 mL生理盐水中，此为1×10-2稀释液。以此类推，做到1×10-6梯度（此操作均在无菌条件下进行）。

2.3 5种品牌酸奶中乳酸菌的活菌数计数

取上述6个连续稀释度的稀释液0.1 mL分别置于2个MRS琼脂平板上，使用L形棒进行表面涂布，倒置41℃兼性厌氧培养48 h（从样品稀释到平板涂布整个试验过程要求在20 min内完成）。选取菌落数为30～300的平板进行计数，计数方法是每1 mL样品中的乳酸菌数=该皿内的乳酸菌数×稀释倍数。方法参考国标GB/T 4789.35—2010。

2.4 5种品牌酸奶中乳酸菌的分离纯化

乳酸菌在MRS培养基上菌落特征见表1。

表1　乳酸菌在MRS培养基上菌落特征

根据乳酸菌在MRS培养基上菌落特征，挑选3个或3个以上可疑单菌落，嗜热链球菌接种于MC培养基，保加利亚乳杆菌接种于加碳酸钙（按3％ M/V的量加入灭菌碳酸钙）并酸化的MRS培养基，倒置41℃兼性厌氧培养48 h。

2.5乳酸菌的纯培养

酸奶中保加利亚乳杆菌在酸化的MRS培养基上菌落直径为1～3 mm，无色素，呈白色至淡灰色，菌落表面较粗糙，菌落周围产生碳酸钙的溶解圈[11]。酸奶中嗜热链球菌在MC培养基上可见红色菌落，表面光滑、边缘整齐，菌落大小为2 mm左右[12]。每种菌种挑选3个可疑菌落接种于斜面培养基上，每个菌落接种3个斜面培养基，置于41℃下兼性厌氧培养48 h。

2.6乳酸菌纯种的形态鉴定

从斜面培养基上选取单菌落进行甲苯胺蓝染色。保加利亚乳杆菌菌体形态多样，呈长杆状，弯曲杆状或短杆状，无芽孢。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径0.5～2.0 mm，成对或呈链排列，无芽孢。

2.7乳酸菌浓度的确定

2.7.1接种

用接种环无菌操作取保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌1～2环分别放入200 mL的MRS液体培养基中，于41℃下恒温培养。

2.7.2培养

分别于0，4，6，8，10，12，16，20 h取出10 mL培养液放冰箱中储存，待测定。

2.7.3活菌计数

将待测试样进行梯度稀释至10-5，取0.2 mL按GB/T 4789.35—2010进行乳酸菌活菌数检验，以活菌数为1.50×108CFU/mL的时间为最佳培养时间。

2.8含菌培养基的制备

用无菌棉签沾取菌液，在试管内壁挤压出多余液体后，涂布MRS平板，连续涂布3次，每次旋转60°，最后绕平板边缘涂抹1周，将平皿盖微开3～5 min，待培养基表面多余水分被吸收后，盖上平皿盖，配置好的菌悬液应在15 min内使用。

2.9乳酸菌的耐药性测定

每个培养皿取一个位置为基准点，并用记号笔在背面做上标记，抗菌药物纸片以顺时针方向贴加，其顺序为多西环素、万古霉素、头孢吡肟、庆大霉素、四环素、链霉素以及红霉素。用镊子贴抗菌药物纸片，每次镊子夹纸片前灼烧灭菌，纸片贴上后轻压确保其贴牢，纸片贴后位置不应再移动。两纸片中心距离＞24 mm，纸片距平板内缘＞15 mm。置于41℃下兼性厌氧培养48 h。

2.10乳酸菌耐药性结果判定标准

用刻度尺量取抑菌环直径，根据美国临床实验室标准化协会CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）报告[13]判断细菌对该抗生素是敏感（susceptible S）、耐药（resistant R）还是中介（intermediate I）。

细菌耐药性解读标准见表2。

表2　细菌耐药性解读标准

3结果与分析

3.1 5种品牌酸奶中乳酸菌的含菌量

5种品牌酸奶中乳酸菌的含菌量见表3。

表3　5种品牌酸奶中乳酸菌的含菌量

由表3可以看出，A品牌酸奶中乳酸菌活菌数最多，其次是D品牌，乳酸菌数最少的是品牌E。国家质量技术监督局发布的酸奶国家标准（GB/T 4789.35—2010）中规定[14]，产品中的乳酸菌数不得低于1×106CFU/mL。其中，低于国家标准规定的有1份样品，这可能是由于该菌种的耐氧性能较差，而在试验过程中无法提供严格厌氧环境；但也不排除在添加菌种的过程中，没有做好品质控制，混匀不均，致使不同批次产品中含有的益生菌数量不同；同时，也不排除菌株自身品质的问题。

3.2乳酸菌的初步鉴定

从5种品牌分离纯化菌株的初步鉴定试验结果。

菌株1.1122见图1，菌株1.2122见图2，菌株1.3121见图3，菌株1.5121见图4，菌株1.3232见图5。

图1　菌株1.1122

图2　菌株1.2122

图3　菌株1.3121

图4　菌株1.5121

图5　菌株1.3232

对酸奶样品进行分离后，共得到5株纯菌株，其菌落特征与乳酸菌符合。甲苯胺蓝染色镜检初步判断其中菌株1.1122、菌株1.2122、菌株1.3121及菌株1.5121为杆菌，菌株1.3232为球菌，总之共获得杆菌4株、球菌1株。获得纯的球菌明显少于杆菌，原因可能是球菌对杆菌的依赖性更强，离开杆菌球菌很难生长；也可能是在分离过程中使用的培养基对球菌的选择性更差。

3.3细菌浓度的确定

乳酸菌达到0.5麦氏（1.50×108CFU/mL）浓度时所需要的培养时间见表4。

表4　乳酸菌达到0.5麦氏浓度时所需要的培养时间

由表4可以看出，对乳酸菌进行液体培养后，乳酸菌的对数生长期在6～14 h，找到A，B，C这3种品牌的乳酸菌培养时间为8 h时，细菌浓度达1.50× 108CFU/mL；D与E这2种品牌的乳酸菌培养时间为10 h，细菌浓度达1.50×108CFU/mL。

3.4乳酸菌的耐药性测定结果

菌株1.1122的耐药性见图6，菌株1.2122的耐药性见图7，菌株1.3121的耐药性见图8，菌株1.5121的耐药性见图9，菌株1.3232的耐药性见图10，乳酸菌的耐药情况见表5。

图6　菌株1.1122的耐药性

图7　菌株1.2122的耐药性

图8　菌株1.3121的耐药性

图9　菌株1.5121的耐药性

图10　菌株1.3232的耐药性

表5　乳酸菌的耐药情况

由表5可以看出，5株菌株均对链霉素耐药，没有菌株对头孢吡肟、四环素、红霉素以及多西环素耐药；以上结果与秦宇轩和李晶等人[15]的报道一致。3株菌株对庆大霉素和万古霉素耐药。所检测的5株乳酸菌均对四环素类、β-内酰胺类和大环内酯类抗生素表现为敏感，这与Charteris，Coppola和Zhou等人[16-18]的研究结果一致。乳酸菌对氨基糖苷类抗生素和万古霉素的耐受性属于天然耐药，检测的5株乳酸菌均对链霉素表现为耐药，有3株对庆大霉素表现为耐药，有3株对万古霉素耐药，以上结果与Mathur，Hummel和Danielsen等人[19-21]的报道一致。

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Shaanxi Province where the Separation of Lactic Acid Bacteria in Yogurt Identification and Drug Resistance Analysis

LIANG Ningli，JU Yajie，FENG Yanyun，GONG Pengbo
（Baoji Entry- exit Inspection and Quarantine Bureau，Baoji，Shaanxi 721006，China）

Abstract：This paper from 5 kinds of lactic acid bacteria is isolated in shaanxi provinces and cities selling place of yogurt，the separation of lactic acid bacteria strains to doxycycline，vancomycin，cefepime，gentamycin，tetracycline，streptomycin and erythromycin the 7 kinds of antibiotic resistance. Using MRS culture medium and cultivated by streak MC medium separation of lactic acid bacteria in yogurt samples，toluidine blue staining the primary identification of the isolates，resistance comparison by disc diffusion method at the same time. Isolated from five brand yogurt of the communist party of China from 5 strains，4 strains bacillus，staphylococcus aureus 1 strain，by disc diffusion method for determination of resistance acquired drug resistance phenotypes are not detected.

Key words：Lactobacillus bulgaricus；Streptococcus thermophilic；separate；drug resistance

作者简介：梁宁利（1981—），女，本科，工程师，研究方向为食品检测。

收稿日期：2016- 01- 14

文章编号：1671- 9646（2016）03a- 0040- 04

中图分类号：R155.5

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.011