响应面法优化灵芝蛋白质提取工艺

陈　濠，贾瑞博，范锦琳，陈艺煊，王　莹，陈紫红，赵立娜，刘　斌，

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州　350002；2.国家菌草工程技术研究中心，福建福州　350002）



响应面法优化灵芝蛋白质提取工艺

陈濠1，贾瑞博1，范锦琳2，陈艺煊1，王莹1，陈紫红1，赵立娜2，*刘斌1，2

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州350002；2.国家菌草工程技术研究中心，福建福州350002）

摘要：以灵芝蛋白质的提取率为指标，考察液料比（V/W）、时间、温度及pH值对提取率的影响，在单因素试验的基础上，采用响应面分析方法确定灵芝蛋白质的最优提取工艺。结果表明，灵芝蛋白质最佳提取工艺条件为液料比（V/W）120∶1，温度50℃，pH值10，时间60 min，沉淀pH值3，在此优化工艺下灵芝粗蛋白的实际提取率达39.7％。

关键词：灵芝蛋白质；响应面分析法；提取工艺

0　引言

灵芝（Ganoderma lucidum）属于担子菌亚门、层菌纲、多孔菌目、灵芝科，是灵芝属中分布最广的物种，因其子实体中含有大量的药理成分，而被视为极珍贵的药用真菌[1-2]。灵芝蛋白质是除了灵芝多糖和三萜外又一类重要的活性物质，由于其具有独特的免疫原性，故其在免疫调节和抗病毒、抗肿瘤病等方面都具有显著的效果[1]。对灵芝蛋白质的提取工艺进行优化，探讨影响灵芝中粗蛋白提取的因素，利用响应面分析法来进行试验优化，从而得到最佳的工艺参数。

1材料与方法

1.1材料与仪器

灵芝，江西井冈山井祥菌草生态科技股份有限公司产品；氢氧化钠（NaOH）、浓盐酸（HCl），分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司产品。UV- 1600型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；KDC- 40型低速离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司产品；J- 25I型高速离心机，美国BECKMAN公司产品；循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司产品；FE20型精密pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；FD- 3型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品。

1.2灵芝粗蛋白的提取工艺

灵芝→碱提→纱布过滤→滤液→酸沉（调pH值进行蛋白沉淀）→4 500 r/min离心→沉淀→冷冻干燥→灵芝粗蛋白。

1.3灵芝粗蛋白含量的测定灵芝总蛋白的含量采用凯氏定氮法[3]测定，灵芝粗提液蛋白的含量采用考马斯亮蓝法[4]测定。蛋白质提取率的计算公式：

1.4灵芝粗蛋白提取的单因素试验

1.4.1液料比对灵芝粗蛋白提取率的影响

称取灵芝，分别按液料比（V/W）20∶1，40∶1，60∶1，80∶1，100∶1，120∶1，140∶1加入蒸馏水，调节pH值至8，置于50℃下水浴60 min，以转速4 500 r/min，25℃下离心10 min，取上清液，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，以考察液料比对灵芝粗蛋白提取率的影响。

1.4.2时间对灵芝粗蛋白提取率的影响

称取灵芝，按液料比（V/W）80∶1加入蒸馏水，调节pH值至8，置于50℃下分别水浴20，30，40，50，60，70，80 min，以转速4 500 r/min，25℃下离心10 min，取上清液，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，以考察时间对灵芝粗蛋白提取率的影响。

1.4.3温度对灵芝粗蛋白提取率的影响

称取灵芝，按液料比（V/W）80∶1加入蒸馏水，调节pH值至8，分别置于25，35，45，55，65，75，85℃下水浴60 min，以转速4 500 r/min，25℃下离心10 min，取上清液，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，以考察温度对灵芝粗蛋白提取率的影响。

1.4.4 pH值对灵芝粗蛋白提取率的影响

称取灵芝，按液料比（V/W）80∶1加入蒸馏水，调节pH值分别为7，8，9，10，11，置于50℃下水浴60 min，以转速4 500 r/min，25℃下离心10 min，取上清液，采用考马斯亮蓝测定蛋白含量，以考察pH值对灵芝粗蛋白提取率的影响。

1.5响应面试验设计

根据Box- Behnken试验设计原理及单因素试验确定需要的各因素水平范围，选取pH值、时间、温度和液料比4个因素各3个水平共29个试验点进行响应面分析试验。零点试验重复5次，用以提高试验误差估计的灵敏度和准确度[5]。

响应面因素与水平设计见表1。

表1　响应面因素与水平设计

1.6灵芝粗蛋白沉淀的pH值范围确定

取蛋白提取液，用1 mol/L的HCl调pH值分别为2，3，4，5，6，静置30 min后以转速4 500 r/min离心10 min，取沉淀冷冻干燥。

2结果与讨论

2.1灵芝总蛋白含量的测定

采用凯氏定氮法测得灵芝总蛋白含量为12.07％。

2.2牛血清白蛋白标准曲线的绘制

参考文献[4]，以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标、以吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线，得回归方程为Y=0.000 7X+0.041 6（R2=0.999 8），线性关系良好。

2.3单因素试验

2.3.1液料比对灵芝粗蛋白提取率的影响

液料比对灵芝粗蛋白提取率的影响见图1。

图1　液料比对灵芝粗蛋白提取率的影响

由图1可知，在液料比40∶1～120∶1，灵芝粗蛋白提取率随液料比的增大而增大；在液料比为120∶1时，提取率达到最大值；之后随着液料比的增大，提取率无显著性增加。考虑到经济成本及后续试验的处理过程，本试验选择液料比120∶1为最佳液料比。

2.3.2时间对灵芝粗蛋白提取率的影响

时间对灵芝粗蛋白提取率的影响见图2。

图2　时间对灵芝粗蛋白提取率的影响

由图2可知，随着时间的增加，灵芝粗蛋白提取率也随之增加，当时间达到50 min之后，提取率随着时间的增加而下降，此结论与刘永等人[6]的研究结果一致。这可能是因为时间变长，溶液的黏度变大，分子的运动速率减慢，阻止蛋白溶解到溶液中去，从而使提取率下降，并且也会增加非蛋白成分与蛋白共沉淀的机会[6]。因此，确定时间为50 min。

2.3.3温度对灵芝粗蛋白提取率的影响

温度对灵芝粗蛋白提取率的影响见图3。

由图3可知，随着温度的升高，灵芝粗蛋白提取率也随之增大；但温度升高到65℃之后，再继续上升，灵芝粗蛋白提取率反而下降。这可能是由于温度升高有利于蛋白的溶解，但温度过高使蛋白质的疏水基团暴露和展开，蛋白质分子聚集，溶解度下降，导致蛋白质提取率下降。所以，确定温度为65℃。

图3　温度对灵芝粗蛋白提取率的影响

2.3.4 pH值对灵芝粗蛋白提取率的影响

pH值对灵芝粗蛋白提取率的影响见图4。

图4　pH值对灵芝粗蛋白提取率的影响

由图4可知，随着pH值的增大，灵芝粗蛋白的提取率不断地增大；但当pH值大于10时，提取率反而呈现出下降的趋势。这是因为pH值过高会引起蛋白质发生分解或者变性等不良反应。J S Hamada等人建议，进行可溶性蛋白提取时pH值最好低于9，否则会影响蛋白质商用品质。因此，确定pH值为9。

2.4响应面分析法优化灵芝粗蛋白的提取工艺

2.4.1数学模型的建立及显著性检验

灵芝粗蛋白提取响应面分析及结果见表2。

表2　灵芝粗蛋白提取响应面分析及结果

运用Design- Expert软件对表2的29个试验点响应值进行回归分析，以灵芝粗蛋白提取率为响应值，经回归拟和后，各试验因素对响应值的影响可通过如下回归方程表示：

回归方程的方差分析结果见表3。

表3　回归方程的方差分析结果

对于提取率来说，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著（R2=0.957 8），该方程是高度显著的，说明响应值的变化有95.78％来源于所选变量，即液料比、pH值、温度、时间，因此该回归方程对试验拟合情况较好，可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。若p＜0.05方程是显著的，则由表3方差分析表可知，A，B，C，D，AB，AC，AD，BC，BD项的影响是显著的，影响因素的顺序为时间＞液料比＞pH值＞温度。其回归方程的各项方差分析结果表明，对于一次项来说，时间和液料比是影响灵芝粗蛋白提取率的主要因素；对于二次项来说，CD是由单因素中的显著因素变成不显著因素，因此各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。所以，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。

2.4.2响应面试验分析及提取工艺的优化

各因素的交互作用影响见图5。

图5　各因素的交互作用影响

利用Design- Expert软件对回归方程进行统计分析，在保持其他因素不变的条件下，将回归模型进行降维处理分析，以考察因素间的交互作用对灵芝粗蛋白提取率的影响。根据回归分析结果，作出响应面和等高线图。响应值存在最大值，各参数间的等高线呈椭圆形，相互作用显著，而且能清晰地看到最高点。说明时间、pH值、温度、液料比相互作用显著。

利用Design- Expert软件由所建的数学模型进行参数最优分析，得出提取最高灵芝粗蛋白含量的参数条件为液料比127.22∶1，温度52.56℃，时间59.37 min，pH值10.05；此优化工艺下，灵芝蛋白提取率的预测值为41.4％。为适合试验操作，调整条件为液料比120∶1，温度50℃，时间60 min，pH 值10。对试验进行验证得灵芝粗蛋白提取率为39.7％，该回归方程可应用于实践。

2.5沉淀粗蛋白的pH值范围

考虑到灵芝粗蛋白的制备，以调节pH值沉淀法作为沉淀灵芝粗蛋白的方法。

不同pH值对灵芝粗蛋白沉淀率的影响见图6。

由图6可知，pH值在3.0左右时，蛋白沉淀量变化很小，且在较高水平。随着pH值的增大，沉淀量减少；当pH调至5时，几乎无沉淀析出。因此，选择pH值为3。在此条件下，灵芝蛋白的沉淀率为88.59％。

3　结论

利用软件由所建的数学模型进行参数最优分析，得出提取最高灵芝粗蛋白含量的参数条件为液料比127.22∶1，温度52.56℃，时间59.37 min，pH值10.05，沉淀pH值3。在此优化工艺条件下，灵芝粗蛋白提取率的预测值为41.4％。

为适合试验操作，调整条件为液料比120∶1，温度50℃，时间60 min，pH值100，沉淀pH值3，对试验进行验证得到灵芝粗蛋白质提取率为39.7％，通过验证试验所得实际值与模型预测值较为接近，证明应用响应面法优化灵芝粗蛋白提取是准确可行的，并为灵芝粗蛋白的进一步研究提供理论依据。

[1]周选围，林娟，李奇璋，等.灵芝蛋白类活性成分的研

图6　不同pH值对灵芝粗蛋白沉淀率的影响

究进展[J] .天然产物研究与开发，2007（19）：917-924.

[2]黄生权，敖宏，曾凡逵，等.灵芝蛋白酶解产物分析及其抗氧化活性的研究[J] .现代食品科技，2013，29（1）：24-28.

[3]张永华.食品分析[M] .北京：中国轻工业出版社，2007：214-217.

[4]王孝平，邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J] .天津化工，2009，23（3）：40-42.

[5]刘海彬，张炜，陈元涛，等.响应面法优化泡沫分离桑叶蛋白工艺[J] .食品科学，2015，36（8）：97-102.

[6]刘永，梁春侣.蛋清蛋白成分分析与提取工艺优化的研究[J] .粮油加工，2010（9）：123-125.

Response Surface Optimization of Protein Extraction from Ganoderma Lucidum

CHEN Hao1，JIA Ruibo1，FAN Jinlin1，2，CHEN Yixuan1，WANG Ying1，CHEN Zihong1，ZHAO Li'na2，*Liu Bin1，2
（1. College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China；2. China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology，Fuzhou，Fujian 350002，China）

Abstract：The protein extraction rate is taken as index to study the effect of ratio of material：liquid- material ratio（V/W），extraction time，temperature and pH on extraction yield. On the basis of single factor experiments，the optimized protein extraction process is analyzed by response surface method. The results show that the optimal Ganoderma lucidum protein extraction conditions are as follows：liquid- material ratio（V/W）of 120∶1，extraction temperature of 50℃，pH of 10，extraction time of 60 min，and precipitation pH of 3. And the real extraction ratio obtained by these optimized conditions is 39.7％.

Key words：Ganoderma lucidum protein；response surface analysis；extraction process

*通讯作者：刘斌（1969—），男，博士，教授，研究方向为食品生物技术。

作者简介：陈濠（1991—），男，在读硕士，研究方向为食品生物技术。

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（31501432）。

收稿日期：2016- 01- 13

文章编号：1671- 9646（2016）03a- 0033- 04

中图分类号：TQ464.7

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.009