葛根总黄酮的提取及其降糖功效研究

方洪帅，王艳蕊，肖茜文，何　苗，王佳男，陈　萍

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春　130118；2.吉林省安信食品技术服务有限责任公司，吉林长春　130012）



葛根总黄酮的提取及其降糖功效研究

方洪帅1，王艳蕊1，肖茜文1，何苗2，王佳男1，*陈萍1

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.吉林省安信食品技术服务有限责任公司，吉林长春130012）

摘要：采用乙醇回流法提取葛根总黄酮，通过正交试验优化提取工艺，确定最佳提取工艺为提取温度70℃，提取时间2.5 h，乙醇体积分数80％，料液比1∶20。通过α-葡萄糖苷酶活性的抑制试验测定体外降糖性能，葛根总黄酮对α-葡萄糖苷酶活性抑制率为66.7％。采用四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，经不同剂量组葛根总黄酮连续灌胃4周测定空腹血糖值和糖耐量，结果表明葛根总黄酮低、中、高剂量都可显著（p＜0.05）降低糖尿病小鼠空腹血糖含量，降糖率分别为16.1％，25.6％，23.9％；各给药组小鼠血糖值在0，0.5，1，2 h时均低于模型对照组小鼠，与模型对照组相比均能显著（p＜0.05）抑制糖尿病小鼠餐后血糖的升高，改善糖耐量。

关键词：葛根；黄酮；提取；α-葡萄糖苷酶抑制率；血糖

糖尿病是一种常见的代谢性疾病，是目前世界上威胁人类健康的几大疾病之一。随着人们生活质量的提高和社会的发展，人类糖尿病发病率呈现出逐年上升的态势[1-2]。研究表明，许多中草药对调节血糖和防治糖尿病及其并发症都有特殊的疗效，从药食同源植物中提取有效成分，研制具有降糖功效的食品有助于预防糖尿病的发生，也在解决人类糖尿病的问题上提供有效途径。

葛根（Pueraria lobata）是一种药食同源植物，具有很高的药用价值，其中葛根总黄酮（Pueraria total flavoniods）是葛根最重要的活性物质，多数研究侧重其抗氧化活性。近年来，有关葛根总黄酮降血糖的研究也有一些报道。杜先锋等人[3]分析得出，葛根中黄酮类含量高并且以葛根总黄酮为原料，配以南瓜、大豆蛋白，经混合调配制成葛根降糖食品。本试验采用乙醇回流提取法从葛根中提取葛根总黄酮，利用单因素试验和正交试验优化提取工艺，开展葛根总黄酮、α-葡萄糖苷酶活性抑制试验，研究四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠空腹血糖及糖耐量的影响，探索其降糖规律，为葛根有效成分的利用以及促进葛根降血糖产品提供科学依据。

1材料和方法

1.1材料与试剂

葛根（Puerariae lobata），批号20150520，由吉林龙生科技公司生产；还原型谷胱苷肽，北京鼎国生物技术有限责任公司生产；对硝基苯基-α- D -吡喃葡萄苷，上海蓝季生物公司生产；芦丁标准品，天津一方科技有限公司生产；四氧嘧啶，上海瑞永生物科技有限公司生产；阿卡波糖，拜耳医药保健有限公司生产；葡萄糖测定试剂盒（批号20150603147），上海荣盛生物药业有限公司生产。

1.2主要仪器

WD- 2102型自动酶标仪，北京市六一仪器厂产品；N- 1001D- WA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；H- 2050R型离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；LGJ- 12型冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司产品。

1.3试验方法

1.3.1葛根总黄酮的提取及制备

精确称取10 g葛根干粉，包成滤纸包，用体积比为1∶30的石油醚温度于80℃下进行脱脂回流，至虹吸管中溶液的颜色变为无色即为回流终点。取出滤纸包烘干，用乙醇溶液进行提取、过滤、浓缩，用体积比为1∶1的正丁醇溶液萃取2次，分离出上层的有机相溶液进行浓缩，加入100 mL的60％乙醇溶解，置于4℃冰箱内冷藏过夜，醇沉去多糖杂质，过滤后浓缩至浸膏，冷冻干燥得葛根总黄酮[4-5]。

1.3.2葛根总黄酮提取量测定

（1）标准曲线的制定。精密称取芦丁标准品5 mg，用60％乙醇溶解并定容至50 mL，得0.1 mg/mL的芦丁标准液。吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL上述芦丁标准液至10 mL容量瓶内；加入5％ 的NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置5 min；加入10％ 的Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，静置5 min；加入4％的NaOH溶液4 mL，摇匀；加入60％乙醇溶液定容至刻度线，摇匀。在508 nm的波长下，测定吸光度。以质量（mg）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出线性方程为A=1.454 3X+0.006 7，R2=0.998 0.

（2）葛根总黄酮提取量的计算。将葛根总黄酮提取液用60％乙醇定容至100 mL，精密吸取1 mL，参照标准曲线制定中的操作方法进行反应并测定OD 值A，葛根总黄酮提取量Y（mg/g）计算公式为：

式中：Y——葛根总黄酮提取量，mg/g；

x——反应样品质量，mg；

N——定容的体积与反应样液体积之比；

m——称取的葛根质量，g。

1.3.3葛根总黄酮提取的优化

（1）单因素试验。在其他条件相同的条件下，分别考察提取温度50，60，70，80，90℃，提取时间1，1.5，2，2.5，3 h，乙醇体积分数50％，60％，70％，80％，90％，料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，4个单因素对葛根总黄酮提取量的影响。

（2）正交试验。以葛根总黄酮提取量作为试验的衡量指标，在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验设计研究提取温度、提取时间、乙醇体积分数、料液比4个因素对葛根总黄酮提取量的影响，确定最佳提取工艺条件。

正交因素与水平设计见表1。

表1　正交因素与水平设计

1.4葛根总黄酮体外降糖功效测定

（1）设计反应体系。67 mmol/L PBS缓冲液870 μL（pH值6.8），1 mg/mL谷胱甘肽溶液25 μL，1 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液35 μL，样品100 μL，37℃水浴反应10 min加入1 mmol/L PNPG 70 μL，37℃水溶反应15 min，然后加入4 mL 0.1 mol/L Na2CO3终止反应，于400 nm处测吸光度[6-7]。

（2）样品对照组用等量的PBS缓冲液替代酶液。酶组用等量的PBS缓冲液替代样品液；空白组用等量的PBS缓冲液替代酶液和样品液；以上4组的其他操作均与样品组相同。α-葡萄糖苷酶抑制率（％）计算公式为：

式中：A1——样品组吸光度；

A2——样品对照组吸光度；

A3——酶组吸光度；

A4——空白组吸光度。

1.5葛根总黄酮对四氧嘧啶型糖尿病小鼠降糖功效测定

1.5.1四氧嘧啶型糖尿病小鼠的建立

选取18～22 g健康的昆明种小鼠100只，雌雄各半，适应性喂养3 d后，禁食（不禁水）12 h，给予腹腔注射四氧嘧啶生理盐水溶液（200 mg/kg）。正常饲养3 d后再禁食12 h，自由饮水。眼眶静脉取血，采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法，测定小鼠的空腹血糖值。选用空腹血糖值在11.1～26.1 mmol/L并有多饮、多食、多尿的小鼠作为建模成功小鼠[8-9]。

1.5.2动物分组及给药

选取空腹血糖值在11.1～26.1 mmol/L的小鼠60只，每组12只（雌雄各半），随机分为模型对照组、阳性对照组和葛根总黄酮高、中、低剂量组。阳性对照组给予阿卡波糖80 mg/kg，葛根总黄酮组320，160，80 mg/kg，灌胃体积均为10 mL/kg。另取12只健康小鼠（雌雄各半）为正常对照组，正常对照组及模型对照组灌服同体积的生理盐水。每天给药1次，连续4周。分别于第0周、第1周、第2周、第3周、第4周灌胃2 h后（禁食12 h），对各组小鼠眼眶取血测血糖值。

第15天禁食5 h，给药，15 min后灌胃20％葡萄糖溶液（10 mL/kg体质量），眼眶静脉取血，分别测定给予葡萄糖后0，0.5，1，2 h的血糖值，进行糖耐量试验，计算血糖曲线下面积。血糖曲线下面积= 0.25×（0 h血糖值+ 4×0.5 h血糖值+ 3×2 h血糖值）。

1.5.3指标测定

空腹血糖值、糖耐量的测定均参照文献[10]，按试剂盒说明操作。

1.6统计分析

所有试验数据均采用PASW Statistics18软件进行统计分析，各组数据均采用单因素Anova方差分析，结果用平均值±标准差（±s，n=12）表示。

2结果与分析

2.1葛根总黄酮提取单因素试验结果

2.1.1提取温度对葛根总黄酮提取量的影响

提取温度对提取量的影响见图1。

图1　提取温度对提取量的影响

由图1可以看出，提取温度为50～70℃时，随着提取温度的上升，提取量增加；而提取温度超过80℃后，提取量有所下降，并且提取液颜色加深明显。可能由于提取温度过高，使葛根总黄酮分解，或者提取温度过高使葛根粉中淀粉、糖类糊化焦糖化，使体系黏度增加，不利于葛根总黄酮的提取。因此，所选提取温度为70℃。

2.1.2提取时间对葛根总黄酮提取量的影响

提取时间对提取量的影响见图2。

图2　提取时间对提取量的影响

由图2可以看出，提取时间为1～2 h时，随着提取时间的增加提取量逐渐增加；但超过2 h后，提取量增加缓慢。考虑节约能源和费用，缩短提取周期和提高设备利用率，选取的提取时间为2 h。

2.1.3乙醇体积分数对葛根总黄酮提取量的影响乙醇体积分数对提取量的影响见图3。

图3　乙醇体积分数对提取量的影响

由图3可以看出，乙醇体积分数为50％～80％时，提取量随乙醇体积分数的增加而增加；而超过80％后，提取量随乙醇体积分数的增加而下降；在乙醇体积分数为80％时，提取量达到最大值。因此，选定的乙醇体积分数为80％。

2.1.4料液比对葛根总黄酮提取量的影响

料液比对提取量的影响见图4。

图4　料液比对提取量的影响

由图4可以看出，随料液比的增加，葛根总黄酮的提取量呈上升趋势。综合考虑提取成本，采用料液比1∶20进行后续试验。

2.2正交试验结果与最佳组合的确定

正交试验结果与极差分析见表2。

由表2可以看出，A，B，C，D这4个因素中，极差从大到小依次为C，A，B，D，极差越大则该因素对试验结果的影响越大，表明4个因素对葛根总黄酮提取量的影响依次为乙醇体积分数＞提取温度＞提取时间＞料液比。而最适的提取条件为A2B3C2D2，即提取温度70℃，提取时间2.5 h，乙醇体积分数80％，料液比1∶20。在此组合条件下进行验证试验3次，取平均值得出葛根总黄酮提取量为18.2 mg/g。

表2　正交试验结果与极差分析

2.3葛根总黄酮体外降糖功效测定

葛根总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制率见图5。

图5　葛根总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制率

按照1.4方法测定葛根总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制率。由图5可以看出，随着葛根总黄酮质量浓度的增大，葛根总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制率也增大；质量浓度达到8 mg/mL时抑制率增长缓慢，达到了最大值66.7％，表明在8 mg/mL时葛根总黄酮与α-葡萄糖苷酶活性位点的结合达到饱和，因此则葛根总黄酮抑制α-葡萄糖苷酶活性的最适质量浓度为8 mg/mL。葛根总黄酮具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶活性，是良好的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

2.4葛根总黄酮对四氧嘧啶型糖尿病小鼠的降血糖研究

2.4.1葛根总黄酮对四氧嘧啶型糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影响

表3　葛根总黄酮对糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影响（±s，n=12）

表3　葛根总黄酮对糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影响（±s，n=12）

组别空腹血糖值/ mmol·L-1第0周　　第1周　　第2周　　第3周　　第4周正常对照组模型对照组阳性对照组葛根总黄酮低剂量组葛根总黄酮中剂量组葛根总黄酮高剂量组6.19±0.23 21.79±0.49 14.21±0.45ab15.74±0.49abc14.62±0.40ab14.70±0.31ab注：a与正常对照组相比，p＜0.05；b与模型对照组相比，p＜0.05；c与阳性对照组相比，p＜0.05 5.80±0.21 20.27±0.90 20.66±0.60a18.75±1.15a19.65±1.14a19.31±0.46a6.26±0.51 21.95±0.49 18.31±0.64ab18.92±0.60ab18.39±0.40ab18.74±0.62ab5.99±0.66 21.82±1.40 17.14±0.28ab17.80±0.11abc17.08±0.34ab17.56±0.29ab6.12±0.32 21.39±1.06 16.13±0.34ab17.12±0.78abc15.52±0.56ab16.08±0.98ab

由表3可以看出，阳性对照组和葛根总黄酮组小鼠与模型对照组相比，血糖从第1周开始显著下降（p＜0.05），之后持续降低，说明葛根总黄酮和阿卡波糖不仅具有降低血糖的作用，这种降血糖作用还具有一定的持续性。至第4周葛根总黄酮高、中、低剂量组小鼠和阳性对照组小鼠的降糖率分别为16.1％，25.6％，23.9％，31.2％，葛根总黄酮高、中剂量组的降血糖效果与阳性对照组相比差异不显著。

2.2.2葛根总黄酮对糖尿病模型小鼠糖耐量的影响

表4　葛根总黄酮对糖尿病模型糖耐量的影响（±s，n=12）

表4　葛根总黄酮对糖尿病模型糖耐量的影响（±s，n=12）

组别　0 h　7 h　14 h　21 h正常对照组模型对照组阳性对照组葛根总黄酮低剂量组葛根总黄酮中剂量组葛根总黄酮高剂量组血糖值　/ mmol·L-1血糖曲线下面积/ mm215.48±1.26 50.37±1.82a37.63±2.02ab42.07±1.23ab39.50±2.41ab40.54±1.08ab注：a与正常对照组相比，p＜0.05；b与模型对照组相比，p＜0.05 6.12±0.32 21.30±0.91a17.04±0.11a17.69±0.36a17.02±0.24a17.42±0.19a8.65±1.58 27.19±1.71a20.35±1.06ab22.19±1.60ab20.81±2.52ab21.42±1.73ab7.65±1.28 25.19±1.71a19.35±0.96ab21.49±1.20ab19.61±2.12ab20.38±1.33ab7.05±0.58 23.81±0.64a17.36±0.21ab20.61±0.67ab19.25±0.56ab19.69±0.30ab

由表4可以看出，给予不同葛根总黄酮剂量及阿卡波糖的小鼠血糖值在0，0.5，1，2 h时均低于模型对照组小鼠，各给药小鼠的血糖曲线下面积均明显低于模型对照组，经统计学检验表现为差异显著（p＜0.05）。这表明葛根总黄酮能抑制糖尿病小鼠餐后血糖的升高，其中尤以葛根总黄酮中剂量组对糖尿病小鼠糖耐量的改善最为明显。

3　结论

采用乙醇回流法提取得到葛根总黄酮，利用单因素试验和正交试验优选出的提取工艺稳定，此法可行，较铅沉淀提取法、渗滤法、酶解法，不需要特殊设备、操作简单、安全环保，更适合工业化生产。

现阶段发现的降血糖机理主要为2个方面，一个是对降糖代谢过程中α-葡萄糖苷酶活性的调节作用，另一个是对激素水平的调节作用[11]。研究发现，糖尿病小鼠α-葡萄糖苷酶活性增加，这些改变可能是糖尿病小鼠多饮多食、摄入过量的碳水化合物、诱导小肠黏膜消化吸收适应性改变造成。已有研究发现，糖尿病小鼠小肠葡萄糖糖转运适应性增强[12]。优选出更好的α-葡萄糖苷酶抑制剂，已成为治疗糖尿病的有效途径。通过α-葡萄糖苷酶活性抑制试验，并且测定糖尿病小鼠空腹血糖值和糖耐量，评价葛根总黄酮不同剂量组的降糖效果，从而分析其降糖规律[13]。研究表明，葛根总黄酮质量浓度为8 mg/mL时能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，不同剂量组均能有效降低糖尿病小鼠的空腹血糖值，中剂量组效果接近阳性药物阿卡波糖，与苗明三等人[8]研究结果基本一致。葛根总黄酮能抑制糖尿病小鼠餐后血糖的升高，明显降低糖尿病小鼠血糖曲线下面积，显著增强糖尿病小鼠葡萄糖的负荷糖耐量，可以通过抑制小肠中α-葡萄糖苷酶的活性，降低葡萄糖的吸收，从而降低血糖含量。但有关葛根总黄酮其他降血糖机理还需进一步研究探讨。

葛根总黄酮能有效持续地降低糖尿病小鼠的空腹血糖值、增强机体的糖耐量、改善糖尿病的发展，因此研究葛根降血糖以及治疗人类糖尿病功能性食品的开发具有良好的理论参考和应用价值。

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Extraction Technology of Puerariae Total Flavonoids and Hypoglycemic Effect

FANG Hongshuai1，WANG Yanrui1，XIAO Qianwen1，HE Miao2，WANG Jia'nan1，*CHEN Ping1
（1. College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118，China；2. Anxin Food Technology Services of Limited Liability Company in Jinlin Province，Changchun，Jilin 130012，China）

Abstract：Ethanol reflux method，orthogonal test are used to optimize the extraction technology of total flavonoids from Pueraria. The optimum extraction of Pueraria total flavonoids：extraction temperature 70℃，extraction time 2.5 h，80％ ethanol concentration，material liquid than 1∶20. Hypoglycemic lowering effect is measured in vitro by the inhibitory to the activity of α- Glucosidase. The inhibition rate of Pueraria total flavonoids on the activity of α- Glucosidase is 66.7％，alloxan diabetic mice as model treated with different dose Pueraria total flavonoids for 4 weeks，then determining the blood glucose values and tolerance. The results of the low，medium and high doses total flavonoids of Pueraria all can be significantly（p＜0.05）reduced fasting blood glucose levels in diabetic mice，hypoglycemic rate respectively 16.1％，25.6％，23.9％，each treatment group blood glucose level of diabetic mice in 0，0.5，1，2 h are lower than the model group，they can inhibit the increase of postprandial hyperglycemia in diabetic mice compared to the model group，improveing glucose tolerance，the difference is significant（p＜0.05）.

Key words：Puerariae lobata；flavone；extraction；α- Glucosidase inhibitory rate；blood glucose

*通讯作者：陈萍（1968—），女，博士，教授，研究方向为食品质量与安全。

作者简介：方洪帅（1988—），男，硕士，研究方向为食品质量与安全。

收稿日期：2016- 01- 12

文章编号：1671- 9646（2016）03a- 0006- 05

中图分类号：Q503

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.002