分光光度法测定红树秋茄中总黄酮含量

计燕萍唐　岚（.嘉兴学院　嘉兴　3400；2.浙江工业大学　杭州　3004）



分光光度法测定红树秋茄中总黄酮含量

计燕萍1唐岚2*（1.嘉兴学院嘉兴314001；2.浙江工业大学杭州310014）

摘要：目的：建立红树秋茄中总黄酮含量的测定方法。方法：采用紫外分光光度法，通过单因素试验优选显色方法和显色条件，建立总黄酮含量的测定方法。结果：采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法，以芦丁作为对照品，在0.02～0.1mg/mL浓度范围内线性关系良好，r2=0.9999，平均回收率为103.02%（RSD=2.2%.n=8）。结论：该方法准确、灵敏、重现性好，可用于秋茄总黄酮含量的测定。

关键词：秋茄总黄酮紫外分光光度法含量测定

红树林（Mangrove plants）是热带和亚热带海岸一种特有的植被，为耐盐、常绿乔木或灌木。秋茄（Kandelia candel）为红树科秋茄属植物，本属只有一种，即为秋茄，为红树植物分类中的真红树植物[1]。秋茄一直有民间药用历史，秋茄树皮具有收敛止血、生肌敛疮的功效，主治外伤出血、水火烫伤。根可祛风除湿主治慢性风湿性关节炎[2]。现有研究表明秋茄中的化学成分主要有黄酮类、鞣质类、甾醇类、脂肪酸和多糖等[3]。药理研究发现秋茄具有抑菌、抗肿瘤、抗胃溃疡[4～6]等作用，但其含量测定的相关报道较少。本实验拟采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法，建立红树秋茄总黄酮含量的测定方法，为秋茄的质量控制提供参考。

1　仪器与材料

1.1实验与仪器：芦丁对照品（中国食品药品检定研究院）；大孔树脂AB-8（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、95%乙醇为分析纯，纯化水为自制。紫外-可见分光光度计（日本岛津RF-540型）；电子分析天平（北京赛多利斯BS224S型）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHIR210型）。

1.2药材来源与鉴定：秋茄采自浙江省乐清市西门岛南岙村滨海湿地，经福建医科大学张永红教授鉴定为红树科植物秋茄（Kandelia candel）。

药材前处理：将秋茄叶洗净沥干剪碎，置37℃烘箱内烘干，粉碎机粉碎，过二号筛，得秋茄叶粗粉放置干燥器中备用。

2　方法与结果

2.1对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10mg，加入适量60%乙醇加热溶解后定容于50mL容量瓶中，摇匀备用。

2.2供试品溶液的制备：样品的制备：精密称取100g秋茄粗粉于圆底烧瓶中，80℃水浴加热，60%乙醇回流提取3次，每次1h。提取液抽滤后旋转蒸发至无醇味，离心得上清液。将上清液过大孔树脂AB-8，60%乙醇洗脱。收集洗脱液旋转蒸发至稠浸膏，冷冻干燥至粉末，在干燥器中保存。

供试品溶液的配制：取适量秋茄总黄酮粉末，60%乙醇溶解定容，摇匀备用。

2.3测定波长的确定：精密量取芦丁对照品溶液、供试品溶液各1.0mL，分别加入5%NaNO2溶液0.6mL，摇匀，放置6min。再加入10% Al（NO3）3溶液0.6mL，摇匀，放置6min。加入1mol/ LNaOH溶液6mL，60%乙醇定容，摇匀。以60%乙醇作为参比溶液，在300～700nm范围内扫描，结果对照品与样品溶液在500nm处均有最大吸收峰。

2.4标准曲线的建立：分别精密吸取芦丁对照品液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，按照“2.3”的测定方法，以60%乙醇作为参比溶液，于波长500nm处测定吸光度，平行两组，取平均值。以吸光度（A）为纵坐标，芦丁对照品溶液浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程Y=12.6411X-0.0029（r2=0.9999）。

2.5显色条件考察

2.5.1乙醇浓度对吸光度值的影响：精确吸取1.0mL芦丁对照溶液和提取液，分别用纯水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇稀释定容，测定吸光度，平行三组，取平均值，结果见表1，60%乙醇对秋茄黄酮的溶解性较好，对吸光度值的影响小，故采用60%乙醇作为稀释剂，较为合理。

表1　乙醇浓度对吸光度的影响结果

2.5.2显色剂加入时间、显色时间对吸光度值的影响：精确吸取1.0mL芦丁对照溶液和提取液，用60%乙醇稀释定容，每次只改变一个时间因素，其余按上述方法测定吸光度值，平行三组，取平均值，结果见表2。表2表明，加入5%NaNO2溶液后的放置时间对实验结果影响不大，考虑到机器以及人为误差的影响，可以认为加入NaNO2溶液后放置6min没有必要，所以在后续试验中加入NaNO2溶液摇匀后立即加入Al（NO3）3溶液。

加入Al（NO3）3溶液后的放置时间对实验结果有较大影响，从机理上分析可能是铝离子和黄酮化合物形成络合物需要一定的时间才能达到稳定。结果表明，放置6min后的含量测定最高，故选择加入Al（NO3）3溶液6min后再加入NaOH溶液。

加入NaOH溶液的10min内，含量测定结果基本一致，表明在此期间显色后的物质稳定。

表2　显色剂加入时间、显色时间对吸光度的影响结果

综上所述，优化后的含量测定方法为：用60%乙醇稀释和定容样品。样品溶液加入0.6mL 5%NaNO2溶液，摇匀后立即加入0.6mL 10%Al（NO3）3溶液，摇匀后放置6min，加入6mL 1mol/ LNaOH溶液后立即在波长500nm处测定吸光度。该方法耗时少，不影响含量测定结果。

2.6稳定性试验：精密吸取样品提取液1mL，按“2.5”方法显色，每隔10min测定1次吸光度值，连续1h，考察显色的稳定性，结果见表3，表明供试品液在30min内稳定。

表3　稳定性考察结果

2.7精密度试验：精密吸取同一样品提取液1mL，分别置于5个10mL容量瓶中，按“2.5”显色方法测定吸光度，平行三组，计算相对标准差（RSD），结果见表4，RSD为0.65%。

表4　精密度实验结果

2.8重现性试验：按照“2.2”制备相同样品液3份，精密吸取1mL，按“2.5”显色方法测定吸光度，平行三组，计算总黄酮含量及RSD。结果见表5，表明秋茄提取液中平均总黄酮浓度为44.97μg/mL，RSD为1.42%，表明供试品的重现性良好。

表5　重现性考察结果

2.9加样回收率试验：分别精密吸取已知含量的提取液1.0mL，分别精密加入配制的芦丁对照溶液0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL；准确吸取提取液0.5mL于10mL容量瓶中，分别加入芦丁对照溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL。按2.5方法测定加入后的吸光度，计算相对标准差（RSD），结果见表6，回收率平均值为103.02%，RSD为2.2%（n=8），说明该方法测定秋茄总黄酮的含量结果灵敏、准确。

表6　回收率考察结果

3　讨论

本实验采用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，建立了亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠体系测定秋茄中总黄酮含量的方法，并优化了该显色方法。方法学考察显示该法准确、稳定、可靠，为进一步研究秋茄总黄酮提供理论及数据支持。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[J].科学出版社，1982：130.

[2]林鹏，林益明，杨志伟，等.中国海洋红树林药物的研究现状、民间利用及展望[J].海洋科学，2005，29（9）：78-81.

[3]高程海，易湘茜，何碧娟，等.广西红树植物化学成分及生物活性研究进展[J].广西科学院学报，2011，27（3）：251-256.

[4]陈虹，金国虔，李萍，等.红树植物秋茄根提取物的体外抑菌与抗肿瘤活性[J].中国海洋药物，2008，27（5）：15-17.

[5]张蕾.海洋植物秋茄根中二萜类化合物及其抗妇科肿瘤活性的研究[J].青岛医药卫生，2011，43（3）：169-171.

[6]Lin X. H.，Yaojian Fang，Meijuan Wang，Jianfeng Zheng，Zhonghui Su，Wenjin. Cytotoxic and antimicrobial metabolites from marine lignicolous fungi，Diaporthe sp[J]. FEMS Microbiology Letters，2005，251（1）：53-58.

Spectrophotometric Determination of Total Flavonoids in Kandelia candel

Ji Yanping1Tang Lan2*（1.Jiaxing University，Jiaxing 314000，China; 2.Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

Abstract：Objective：To establish a method for determination of the content of total flavonoids in Kandelia candel．Method：single factor tests were adopted to optimize colorimetry methods and conditions by UV FDS，determination of the content of total flavonoids was established．Result：Selecting rutin as a reference substance，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH method was adopted，rutin had a liner relationship with absorbance in the range of 0.02～0.1mg/mL，r2=0.9999，average recovery was 103.02% with RDS of 2.2%，n =8. Conclusion：NaNO2-Al（NO3）3-NaOH method appeared to be an accurate，reliable and repeatable system fordetermination of total flavonoids in Kandelia candel．

Key words：Kandelia candel Total flavonoids Ultraviolet spectrophotometry Determination

*通讯作者

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

文章编号：1672-8351（2016）04-0005-02