低温环境下提高美极梅奇酵母菌生防效果的研究

郭东起，蒋楠，刘亚军，朱丽霞（塔里木大学生命科学学院/南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）



低温环境下提高美极梅奇酵母菌生防效果的研究

郭东起，蒋楠，刘亚军，朱丽霞*
（塔里木大学生命科学学院/南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）

摘要：以美极梅奇酵母菌（Metschnikowia pulcherrima）为试材，通过添加不同的碳源、氮源及保护剂，研究其在低温环境下对拮抗酵母菌的生长及抑菌效果的影响，明确提高其生防功效的方法。结果表明，以蔗糖为碳源，酵母膏为氮源有利于美极梅奇酵母菌在低温条件下生长，体外抑菌效果俱佳，添加0.1 %CaCl2（氯化钙）及2 %海藻糖均能提高美极梅奇酵母菌生防效果。

关键词：低温；美极梅奇酵母菌；生防

冬枣是环塔里木盆地种植的晚熟鲜食品种，以其优良的品质受到消费者的青睐，但由于其含水量高，皮薄肉脆，极易腐烂变质，目前，对冬枣的贮藏绝大部分还停留在传统的化学杀菌剂方面，然而，长期使用化学杀菌剂会造成环境污染，药物残留，进而危害消费者的身体健康[1-2]。利用生防微生物替代传统化学杀菌剂控制果蔬采后病害已成为研究热点[3-5]。M. pulcherrima是从新疆冬枣表面分离获得的生防酵母菌，用于冬枣的采后贮藏中腐烂的防治效果良好[6-7]。但要保证其在冬枣的实际贮藏中发挥更好的生防效果，其必须适应贮藏的低温环境，因此，本试验通过对M. pulcherrima低温环境下，添加不同外源物对拮抗酵母菌的生长及抑菌效果的影响，明确提高拮抗酵母菌生防效果的方法，为新疆冬枣的生物保鲜技术提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1冬枣及菌株

冬枣：采于阿克苏地区阿拉尔市10团，选取大小均一、无病虫害、无机械损伤的8～9成熟的果实，当天运回并贮藏在南疆特色农产品深加工兵团重点实验室冷库[（-2±1）℃，相对湿度（90±5）%]预冷，待用；生防酵母菌种：M. pulcherrima，生工生物工程（上海）有限公司鉴定；橘青霉（Penicilliium citrinum）是新疆冬枣贮藏过程中青腐病的主要病原菌[8]。

1.1.2主要仪器与试剂

LS-B50L型立式压力蒸气灭菌器：上海华线医用核子仪器有限公司；PL203/O1电子分析天平：特勒一托利多仪器（上海）有限公司；DGG-101-2型电热鼓风干燥箱、HH.B 1型电热恒温培养箱：天津市天宇试验仪器有限公司；756紫外分光光度计：长春泰恒仪器表有限公司；等。

牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、蔗糖、麦芽糖、硫酸铵、海藻糖、乳糖、可溶性淀粉、氯化镁、氯化铁、氯化钙等（均为分析纯）。

1.1.3培养基的制备

LB培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH，121℃，灭菌20 min。

1.2方法

1.2.1 M. pulcherrima的扩大培养

在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取2环菌种，转接到装有100 mL NYDB液体培养基的250 mL三角瓶内，28℃下振荡（140 r/min），培养36 h后，4℃冰箱贮存，待用。

1.2.2 M. pulcherrima生长曲线的测定

M. pulcherrima NYDB培养液，按2 %的量接种到不同装有YDP液体培养基的锥形瓶（250 mL锥形瓶，装100 mL YDP液体培养基），4℃下振荡（140 r/min）培养，每1 d取样1次，用无菌水稀释10倍，未发酵的YDP液体培养基作空白对照，测定OD500值，以培养时间为横坐标，OD500值为纵坐标，绘制其生长曲线，试验重复3次，求均值[9]。

1.2.3碳源对M. pulcherrima生长及体外抑菌效果的影响

以LB为基础培养基，分别以2 %的可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖为碳源，在锥形瓶（250 mL）装入150 mL培养基，121℃，灭菌15 min，2 %的接种量，在4℃下培养4、6、8、10、12 d，用分光光度计测定其在OD500，测定其对M. pulcherrima菌体产生量的影响；采用牛津杯法，测定5种碳源对M. pulcherrima菌体外抑菌效果的影响，用消过毒的打孔器（内径为5 mm）从培养7 d的病原菌PDA平板上取菌饼，并将其移至另一PDA平板中央，并对称放置4个牛津杯，用移液枪吸取100 μL含5种不同碳源M. pulcherrima培养液（4℃下培养10 d），注入牛津杯中，其中同一碳源十字交叉放置，于4℃下培养8 d，观察M. pulcherrima和病原菌的生长情况，并测量抑菌圈直径的大小，重复3次，求均值。

1.2.4氮源对M. pulcherrima生长及体外抑菌效果的影响

以PDA为基础培养基，分别添加1 %的牛肉膏，蛋白胨，酵母膏，硫酸铵，每个锥形瓶（250 mL）装150 mL培养基，121℃灭菌，15 min，2 %的接种量，在4℃下培养4、6、8、10、12 d，用分光光度计检测其OD500，测定其对M. pulcherrima菌体产生量的影响；采用牛津杯法，测定4种不同氮源对M. pulcherrima体外抑菌效果的影响，方法同1.2.3所述，重复3次，求均值。

1.2.5海藻糖及金属离子对M. pulcherrima抑菌效果的影响

在NYDB中分别加入0.1 %（0.1 mg/100 mL）CaCl2、MgCl2、FeCl3和2 %（2 mg/100 mL）的海藻糖，添加量根据预试验确定，28℃，振荡（120 r/min）培养24 h，待用。在无菌室，将橘青霉转接到PDA平板上，28℃培养1周，然后用接种环在平板上刮取适量孢子，放入10 mL 含0.05 %Tween-80的无菌蒸馏水中，并用无菌纱布过滤4次，滤去其菌丝体，用血球计数板法计数，调整橘青霉孢子数为1×105spores/mL。选取新鲜冬枣，先用2 % NaClO溶液将其消毒2 min，并用清水冲洗干净，晾干备用。在冬枣表面赤道部位用消过毒的打孔器人工制造一个伤口（3 mm×3 mm×3 mm），接着用移液枪在伤口处加入20 μL（1×105spores/mL）的橘青霉的孢子悬浮液，自然晾干，再分别接种含不同金属离子和海藻糖的NYDB液态培养液25 μL，自然晾干后，将冬枣装入保鲜袋，以只接种橘青霉的冬枣作为对照，置于4℃，RH（90±5）%的环境下贮藏，10 d后，测量冬枣的病斑直径，并计算出腐烂率。每个处理组200个冬枣，重复3次，求均值。

2　结果

2.1M. pulcherrima的生长曲线测定

4℃下，M. pulcherrima在YDP液体培养基NYDB生长曲线测定结果见图1。

图1　4℃下M. pulcherrima的生长曲线Fig.1 Growth curve of M. pulcherrima at 4℃

M. pulcherrima的生长曲线为：0 d～2 d为适应期，2 d～7 d为指数期，7 d～13 d为恒定期，13 d后为衰亡期。

2.2碳源对M. pulcherrima生长及体外抑菌效果的影响

2.2.1碳源对M. pulcherrima生长的影响

碳源对M. pulcherrima生长的影响见图2。

图2　碳源对M.pulcherrima生长的影响Fig.2 Effect of carbon source on the growth of M.pulcherrima

在相同培养条件下，以蔗糖和麦芽糖为碳源时，M. pulcherrima的OD500明显高于以葡萄糖、乳糖及可溶性淀粉为碳源时的OD500，5种不同碳源提高M. pulcherrima菌体生长量的顺序为蔗糖＞麦芽糖＞葡萄糖＞乳糖＞可溶性淀粉。结果表明，蔗糖和麦芽糖更有利于M. pulcherrima在冷胁迫条件下生长。

2.2.2碳源对M. pulcherrima体外抑菌效果的影响

碳源对M. pulcherrima体外抑菌效果见表1。

表1　碳源对M.pulcherrima体外抑菌效果的影响Table 1 Effects of carbon source on antimicrobial of M.pulcherrima

4℃下培养8 d测定蔗糖为碳源时，M. pulcherrima的抑菌圈直径为30 mm，大于其它4种碳源时的抑菌圈直径，结果表明，以蔗糖为碳源，M. pulcherrima体外抑菌效果最好，其抑菌效果见图3。

图3　蔗糖为碳源时M.pulcherrima体外抑菌效果（上、下）Fig.3 Effects of Sucrose as the carbon source on antimicrobial of M.pulcherrima（upper，lower）

因此，添加蔗糖利于M. pulcherrima菌体生长，其体外抑菌效果也最佳，故蔗糖为M. pulcherrima发酵的最佳碳源。

2.3氮源对M. pulcherrima生长及体外抑菌效果的影响

2.3.1氮源对M. pulcherrima生长的影响

氮源对M. pulcherrima生长的影响见图4。

图4　氮源对M.pulcherrima生长的影响Fig.4 Effect of nitrogen source on the growth of M.pulcherrima

在相同培养条件的4种不同氮源对M.pulcherrima菌体生长量的影响顺序为酵母膏＞牛肉膏＞蛋白胨＞硫酸铵，以酵母膏为氮源，M.pulcherrima的菌体生长量明显高于其它3种。

2.3.2氮源对M.pulcherrima体外抑菌效果的影响

氮源对M.pulcherrima体外抑菌效果见表2。

表2　氮源对M. pulcherrima抑菌效果的影响Table 2 Effect of nitrogen source on antimicrobial of M. pulcherrima

4℃下，加不同氮源培养8 d，以酵母膏为氮源时，M.pulcherrima体外抑菌效果最佳，其抑菌圈直径为30 mm，因此，酵母膏对菌体生长量影响较大，其体外抑菌效果显著，故酵母膏为M.pulcherrima发酵的最佳氮源。

2.4海藻糖及金属离子对M.pulcherrima抑菌效果的影响

海藻糖及金属离子对M.pulcherrima抑菌效果的影响见图5，可知，与对照（CK）组的冬枣100 %的腐烂率相比，添加0.1 %（0.1 mg/100 mL）CaCl2、MgCl2、FeCl3和2 %（2 mg/100 mL）海藻糖均能提高M. pulcherrima体内抑菌效果，明显降低橘青霉因起的冬枣腐烂，添加0.1 %CaCl2的NYDB液态培养液抑菌效果最佳，冬枣的腐烂率最低，只有30 %，添加2 %海藻糖的NYDB液态培养液抑菌效果仅次于添加CaCl2抑菌效果，冬枣的腐烂率为35 %；比较对病斑直径的影响，各处理均能降低伤口病斑直径的扩展，添加0.1 %CaCl2及2 %海藻糖的处理的抑制效果较佳，病斑直径分别为10 mm 和11.5 mm。添加适宜浓度的金属阳离子及保护剂能提高美极梅奇酵母菌在冷胁迫条件下的生防效果。

图5　不同处理对接种橘青霉后冬枣伤口病斑直径及腐烂率的影响Fig.5 Effects of different treatment on winter jujube wound decay and lesion diameter after artificial inoculation with P. citrinum

3　讨论

不同的碳源及氮源对M. pulcherrima的生长及抑菌效果的影响各异，以蔗糖为碳源，以酵母膏为氮源时美极梅奇酵母菌在低温条件下生长，体外抑菌效果俱佳，这可能是因为生防酵母菌的初始数量多，有利于增强其与病原菌之间的空间、营养的竞争能力，这与许多学者的研究结果相一致[10-13]。因此，要使拮抗酵母菌发挥更好的抑菌效果，应考虑菌体生长情况，本试验仅从碳源和氮源方面分析了拮抗酵母菌菌体的生长量，发酵条件如接种量、供氧、培养时间、添加微量元素等因子对菌体生长还需进一步的研究[14]。很多外源化学物质，如金属盐类与生防酵母结合使用，能显著提高其生物防治活性；使用Ca2+可以降低了细胞壁降解酶活性，从而增加了果实的硬度，起到增强抑菌效果的作用[15]，本试验添加0.1 %CaCl2明显提高了M. pulcherrima对冬枣青腐病的病原菌的抑制效果，这与孙萍等人的研究结果一致[16]。生防酵母菌还可以通过添加复合脱脂乳、海藻糖、蛋白胨等保护性物质，来增强自身对各种胁迫的适应性，提高其拮抗效力[17]，试验中添加2 %海藻糖能显著提高美极梅奇酵母菌在低温条件下的生防功效，可能是海藻糖作为内源或外源保护因子对细胞质膜和胞内敏感蛋白具有保护作用，能增强细胞对多种胁迫的适应性。

4　结论

4℃下，M. pulcherrima在YPD培养基中的生长曲线为：0 d～2 d为适应期，2 d～7d为指数期，7 d～13 d为恒定期，13 d后为衰亡期；以蔗糖为碳源，以酵母膏为氮源是M. pulcherrima生长及体外抑菌效果俱佳。添加0.1 %CaCl2及2 %海藻糖能提高M. pulcherrima在低温条件下的生防效果。

参考文献：

[1] Tian S, Qin G, Li B, et al. Effects of salicylic acid on disease resistance and postharvest decay control of fruits[J]. Stewart Postharvest Rev,2007(6):1-7

[2]朱丽娅,郜海燕,陈杭君,等．拮抗菌防治果蔬采后病害的概况[J]．浙江农业科学,2013(7):853－857

[3] Janisewicz W J, Korsten L. Biological control of postharvest diseases of fruits[J]. Annual Review of Phytopathology, 2002, 40:411-441

[4]耿鹏.拮抗酵母菌控制果蔬采后病害的研究进展[J].北方园艺, 2010(20):220-225

[5]李静,刘丽娜,王安建,等.果蔬微生物保鲜技术的研究进展[J].食品与生物技术学报,2014,33(4):337-343

[6]郭东起,赵萍,侯旭杰.冬枣采后病害生物防治用拮抗酵母菌的筛选[J].保鲜与加工,2011,11(6):6-9

[7]郭东起,侯旭杰.冬枣的生物涂膜保鲜研究[J].食品研究与开发, 2013,34(5):98-102

[8]郭东起,侯旭杰.冬枣采后青腐病病原菌的分离、鉴定及控制[J].食品研究与开发,2013,34(4):89-93

[9]庄德森.产酯酵母菌培养条件试验[J].中国调味品,2002(6):16-19

[10]范青,田世平,徐勇,等.季也蒙假丝酵母对采后桃果实软腐病的抑制效果[J].植物学报,2000,42(10):1033-1038

[11]丁玥,孟帆,王奎,等．季也蒙毕赤酵母对采后草莓病害控制及冷藏品质的影响[J]．南京农业大学学报,2010,33(4):64－68

[12] Sharma R R, Singh D, Singh R. Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists: Areview[J]. Biological Control,2009,50(3):205-221

[13] Arras G,de-Cicco V,Arru S,et al. Biocontrol by yeasts of blue mold of citrus fruits and the mode of action of an isolate of Pichia guilliermondii[J]. Journal of Horticultural Science and Biotechnology,1998, 73:413-418

[14]张艳春.生防菌B579发酵条件优化及生防效果的研究[D].天津:天津科技大学,2011

[15] Tian S P, Fan Q,Xu Y, et al.Effects of calcium on biocontrol activity of yeast antagonists against the postharvest fungal pathogen Rhizopus stolonifer[J].Plant Pathology,2002,51:352-358

[16]孙萍,郑晓冬,张红印,等.粘红酵母与金属离子结合使用对柑橘采后青霉病的抑制效果[J].果蔬学报,2003,20(2):169-172

[17]周雅涵,罗杨,曾凯芳.拮抗酵母菌对果蔬采后病害生防增效途径及机理研究进展[J].食品科学,2011,32(17):362-365

The Study on Improving the Biocontrol Effect of Metschnikowia pulcherrima under Low Environmental Temperature

GUO Dong-qi，JIANG Nan，LIU Ya-jun，ZHU Li-xia*
（College of Life Science，Tarim University/Xinjiang Production and Construction Group Key Laboratory of Agricultural Products Deep Processing in South Xinjiang，Alar 843300，Xinjiang，China）

Abstract：Taking Metschnikowia pulcherrim as test material，the study on the influence of growth and antibacterial effect of antagonistic yeast by adding different carbon sources，nitrogen sources，and protective agents under cold stress，in order to clarify ways to improve biocontrol effect of antagonistic yeast. The results showed that sucrose as carbon source，yeast extract as nitrogen source was beneficial for growth of M. pulcherrima under cold stress condition，the antibacterial effect in vitro was best，the biocontrol efficacy of M. pulcherrima could significantly improve by adding 0.1 % CaCl2and 2 % trehalose.

Key words：low temperature；M. pulcherrima；biocontrol

收稿日期：2015-01-30

*通信作者：朱丽霞（1975—），女（汉），副教授，硕士，从事食品微生物研究。

作者简介：郭东起（1975—）男（汉），副教授，硕士，从事食品安全及果蔬保鲜与加工技术研究。

基金项目：国家自然科学基金项目（31160342）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.041