蓝莓花色苷对2型糖尿病小鼠氧化损伤的保护作用

李亚巍，昌盛，王黎明，金瑛（吉林医药学院药物化学教研室，吉林吉林132013）



蓝莓花色苷对2型糖尿病小鼠氧化损伤的保护作用

李亚巍，昌盛，王黎明，金瑛*
（吉林医药学院药物化学教研室，吉林吉林132013）

摘要：探讨蓝莓花色苷对2型糖尿病小鼠体内抗氧化活性影响及肝脏的保护作用。采用高脂饮食联合小剂量四氧嘧啶诱导的方法建立小鼠2型糖尿病模型。50只小鼠分为正常对照组、模型组、阳性药（吡格列酮）组、蓝莓花色苷低剂量（100mg/kg·d）给药组和蓝莓花色苷高剂量（200mg/kg·d）给药组。阳性药及蓝莓花色苷给药组，每天灌胃给药1次，连续给药30 d。末次给药12小时后，测定小鼠空腹血糖，血清中及肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，并观察小鼠肝脏组织形态学改变。与对照相比，模型组小鼠空腹血糖维持较高水平（P<0.01），小鼠血清及肝脏组织中SOD、GSH-Px活性明显下降（P<0.01），而MDA含量明显升高（P<0.01），小鼠肝细胞出现变性、间质水肿及炎症细胞浸润病理变化。与模型组相比，阳性药和蓝莓花色苷给药组小鼠血糖明显降低（P<0.01），SOD和GSH-Px活性升高（P<0.01），MDA含量下降（P<0.01），肝脏病理变化有所改善。蓝莓花色苷能够通过减轻实验性2型糖尿病小鼠机体的氧化损伤，并对肝脏损伤具有一定的保护作用。

关键词：蓝莓花色苷；2型糖尿病小鼠；氧化损伤

越橘（Bilberry），又称蓝浆果、蓝莓果，属于杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium.SPP），多年生落叶或常绿灌木[1-2]。蓝莓果实椭圆形或偏球形，蓝紫色，味道酸甜[3-4]，是我国重要的一种天然绿色野生资源，具有很高的营养价值。越橘中含有丰富的花色苷，花色苷是一种广泛存在于植物中的功能性水溶色素，是一种天然的抗氧化剂，具有抗氧化、清除自由基等多种生理活性[5]。因此，其作为具有重要生理活性的天然着色剂，广泛应用于食品、药品行业。国内外对蓝莓花色苷生理功能的研究主要集中在清除自由基作用、抗癌等方面，而其对体内生理活性影响的研究还很少[6]。

本研究将从越橘花色苷抗氧化及对肝脏损伤的保护作用方面，探讨其改善糖代谢的相关机制，为蓝莓花色苷功能食品的开发提供理论参考。

1　材料与仪器

1.1材料与试剂

长白山野生蓝莓为8月份采收，于-80℃冰箱中保存备用，按参考文献[7]方法，提取蓝莓花色苷；高糖高脂饲料（蛋黄2.5 %、蔗糖20 %、猪油10 %、基础饲料67.5 %）；四氧嘧啶：SIGMA公司；盐酸吡格列酮片：江苏恒瑞医药股份有限公司；胆固醇（TC）测定试剂盒、甘油三酯（TG）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒：江苏碧云天生物技术研究所。其他试剂均为国产分析纯。

1.2主要仪器

550酶标仪：美国Bio-Rad公司；UV-4802型紫外可见分光光度计：上海UNICO仪器有限公司；TGL-16G台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂；OLYMPUS光学显微镜：日本奥林巴斯（中国）有限公司；MTN-658自动生化分析仪：长春市曼特诺医疗器械有限公司。

1.3试验动物

选取健康成年KM种小鼠80只，雄性，体重18 g～ 20 g，购于吉林大学基础医学院医学实验动物中心，合格证号SCXK（吉）2008-0005。动物适应性喂养1周后开始实验，室温18℃～28℃，相对湿度62 %～80 %。

2　试验方法

2.1动物前期饲养及处理

参考文献[10]，建立2型糖尿病实验动物模型，试验期间，严格按照动物饲养管理标准和规范进行饲养。随机选取出20只小鼠喂普通饲料，自由饮水，其余小鼠喂高糖高脂饲料，自由饮水。喂养8周后，两组各随机抽取4只小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血，3 000 r/min离心5 min，取血清，进行血脂检测，喂高糖高脂饲料的小鼠血清中TC、TG较对照组显著升高（P< 0.01），表明高脂动物模型建模成功。取高脂模型小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射小剂量四氧嘧啶（180 mg/kg）。72 h后，对小鼠进行尾尖取血，用血糖仪检测小鼠空腹血糖（检测前12 h禁食不禁水），以血糖值≥10 mmol/L为建立2型糖尿病模型标准，筛选造模成功动物。

2.2动物分组及处理

选取喂养普通饲料的小鼠10只作为正常对照组；2型糖尿病模型小鼠随机分成4组，每组10只，分别为模型组、阳性对照组吡格列酮（100 mg/kg·d）、越橘花色苷高剂量组（200mg/kg·d）、越橘花色苷低剂量组（100 mg/kg·d）。灌胃给药，0.1 mL/10 g体重，连续30 d，正常对照组给予等体积生理盐水。除正常对照组外，其余各组继续喂高糖高脂饲料。

2.3生化指标检测

末次给药后，动物禁食12 h采血，小鼠眼球取血，用全自动生化分析仪测定空腹血糖（FBG）。取血后小鼠立即采用颈椎脱臼处死，迅速取出肝脏，以冰冷生理盐水清理血迹，吸干水分，准确称量，并加入9倍无菌的冰冷生理盐水手动制成10 %的心脏匀浆，离心（4 000 r/min，10 min），上清液置于-85℃冰箱待用。严格按照试剂盒说明书分别进行测定血清和肝脏组织中SOD活性、GXH-Px活性、MDA含量。SOD和GXHPx活性及MDA含量的测定方法按照试剂盒说明书进行，用分光光度计测定。

2.4肝脏织病理学检查

小鼠处死后冰浴下立即取小鼠肝脏脏，固定于10 %福尔马林溶液，病理切片常规石蜡包埋、切片、HE染色，观察肝细胞变性及坏死，炎症细胞浸润，间质水肿，血管反应，纤维增生病理学变化。

2.5数据统计

实验数据均以x±s表示，所有实验数据均采用SPSS 13.0软件处理，对照组与给药各组比较进行单因素方差分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

3　试验结果

3.1越橘花色苷对小鼠空腹血糖的影响

通过高脂饮食小剂量四氧嘧啶诱导的方法建立2型糖尿病模型，检测蓝莓花色苷对2型糖尿病小鼠的治疗作用。结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠空腹血糖维持在较高的水平（P<0.01）。而与模型组相比，阳性对照组和越橘花色苷给药组空腹血糖呈现下降趋势，结果见图1。

图1　越橘花色苷对小鼠血糖的影响Fig.1 Effect of Buleberry anthocyanidin on the blood sugar of mouse

3.2越橘花色苷对小鼠血清中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影响

越橘花色苷对小鼠血清中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影响见表1。

表1　越橘花色苷对小鼠血清中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影响Tabe 1 The effect of Buleberry anthocyanidin on the activity of SOD and GSH-Px and the conten of MDA in mouse serum

表1结果显示，与对照组相比，模型组小鼠血清中SOD、GSH-Px酶活力明显降低（P＜0.01），而MDA含量升高明显（P＜0.01）。与模型组相比，阳性对照组及蓝莓花色苷高剂量及低剂量防护组小鼠血清中SOD、GSHPx酶活力升高明显（P＜0.01），而MDA含量降低明显（P＜0.01）。

3.3越橘花色苷对小鼠肝脏中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影响

越橘花色苷对小鼠肝脏组织中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影响见表2。

表2结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肝脏中SOD、GSH-Px酶活力明显降低（P＜0.01），而MDA含量升高明显（P＜0.01）。与模型组相比，阳性对照组及蓝莓花色苷高剂量及低剂量防护组小鼠肝脏中SOD、GSHPx酶活力升高明显（P＜0.01），而MDA含量降低明显（P＜0.01）。由结果可以看出，越橘花色苷能够显著改善

表2　越橘花色苷对小鼠肝脏组织中SOD和GSH-Px活力及MDA含量的影响Tabe 2 The effect of Buleberry anthocyanidin on the activity of SOD and GSH-Px and the conten of MDA in mouse hepar

2型糖尿病小鼠肝脏内氧化应激水平，从而对糖代谢进行调节。

3.4越橘花色苷对2型糖尿病模型小鼠肝脏病理改变的影响

病理切片检测表明，正常组小鼠肝脏组织中见个别肝细胞变性，其余肝细胞无变性坏死，偶见间质血管充血及炎症细胞浸润，未见间质水肿。与正常组相比，模型组小鼠肝脏组织中肝细胞变性、间质血管充血、间质水肿及炎症细胞浸润部分非常明显；与模型组相比，阳性给药组、越橘花色苷高剂量组和低剂量组小鼠肝脏组织中肝细胞变性、间质血管充血、间质水肿及炎症细胞浸润部分明显较少，表明越橘花色苷对2型糖尿病小鼠肝脏组织损伤具有一定的改善作用，见图2。

图2　肝脏组织病理切片（400X）Fig.2 Pathological sections of liver tissues（400X）

4　讨论

近年的研究表明，2型糖尿病是一种与氧化损伤密切相关的内分泌常见疾病，无论是2型糖尿病实验动物还是患者体内，确实存在氧化损伤相关指标的改变，进行抗氧化治疗能抑制或延缓2型糖尿病及其并发症的发生发展[8-10]。目前，国内外对于蓝莓的研究主要集中在抗氧化、抗癌等方面。但有关蓝莓花色苷通过抗氧化改善糖代谢的研究报道很少。本实验采用高脂饮食小剂量四氧嘧啶诱导的方法建立2型糖尿病模型，探讨蓝莓花色苷对对2型糖尿病的治疗作用。

本实验结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠空腹血糖维持在较高的水平，而阳性对照组和越橘花色苷给药组空腹血糖呈现下降趋势，说明蓝莓花色苷对2型糖尿病小鼠具有一定的治疗作用。正常机体内自由基代谢维持动态平衡，是由于存在有效的自由基清除系统。最重要的有SOD和GSH-Px，二者联合起来清除体内的氧自由基。在慢性高血糖状态下SOD和GSH-Px等可发生非酶促糖基化反应，使其清除自由基的能力明显下降，导致脂质过氧化的最终产物MDA生成增多[11]。可以间接反映机体内氧自由基的代谢状况、组织细胞受自由基损伤的程度及脂质过氧化程度[12]。研究结果显示，越橘花色苷能够显著提升2型糖尿病小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力，降低其血清中MDA的含量，说明越橘花色苷能够有效清楚体内活性氧自由基和脂质过氧化物，保护机体免受自由基的损伤。

近年研究发现，肝脏是物质代谢的重要器官，也是常见的糖尿病慢性损伤的靶器官之一，肝脏中存在大量的胰岛素受体，当肝脏得不到滋养时，必然会使代谢所产生的有害物质积聚，进一步损伤肝细胞线粒体，使其能量供应受损，核糖体合成蛋白质的活性下降，肝脏合成蛋白质的能力进而减弱[13]。而肝脏的损伤又会进一步加剧血糖及脂肪代谢的紊乱。本研究结果表明，越橘花色苷对2型糖尿病小鼠肝脏的组织损伤具有一定的改善作用，可以减轻模型动物肝脏组织炎症细胞浸润及变性、水肿等，进而可以修复肝脏功能。

综上所述，蓝莓花色苷能够通过减轻实验性2型糖尿病小鼠机体的氧化损伤，有效改善血糖代谢，并对糖尿病所致的肝脏损伤具有一定的保护作用，其具体作用机制还需进一步研究。

[1]徐璐,郑建仙.欧洲越橘花色苷的研究概况[J].中国食品添加剂, 2005(4): 43-64

[2]李颖畅,孟宪军.蓝莓叶黄酮提取物抗氧化活性的研究[J].营养学报, 2008,30(4): 427-429

[3]杨桂霞,范海林,郑毅男,等.笃斯越橘果实中黄酮类化合物的分离鉴定[J].吉林农业大学学报,2005,27(6):643－644

[4]魏健,关丽华,王秀华.红豆越橘中化学成分的研究进展[J].北方园艺,2007(4):81－83

[5] KONG Jinming, CHIA L S, GOH N K, et al. Analysis and biological activities of anthocyanins[J]. Phytochemistry, 2003(64): 923-933

[6] Garzon G A, Narvaze C E, Riedl K M,et al. Chemical composition, anthocyanins,non anthocyanin phenolics and antioxidant activity of wild bilberry from Colombia[J]. Food Chem,2010,122(4):980－986

[7]朱文赫,徐俊杰,张巍,等.长白山笃斯越橘中花色苷不同提取工艺的研究[J].食品研究与开发,2012,33(4):59-62

[8] Ceriello A. New insights on oxidative stress and diabetic compl ications may lead to a"causal" antioxidant therapy [J]. Diabetes Care, 2003, 26(5): 1589 -1596

[9] Sardesai VM. Role of antioxidants in health maintenance[J].Nutr Clin Pract, 1995, 10(1): 19-25

[10] Ceriello A, M ercuri F, Quagliaro L, et al. Detection of nitroty-rosine in the diabetic plasma: evidence of oxidative stress[J].Diabetologia, 2001, 44(7): 834-838

[11] Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance [J]. Trends in Plant Science, 2002, 7(9):405-410

[12] Barnham K J, Masters C L, Bush A I. Neurodegenerative Diseases And Oxidative Stress[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2004, 3 (3):205-214

[13]王蓉蓉,谢琳,吴晓烨,等.银杏叶提取物对实验性2型糖尿病大鼠肝脏的保护作用[J].中国病理生理杂志, 2007, 23(3):566-569

Protective Effect of Blueberry Anthocyanins on Oxidative Damage in Type 2 Diabetes Mice

LI Ya-wei，CHANG Sheng，WANG Li-ming，JIN Ying*
（Department of Pharmaceutical Chemistry，Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China）

Abstract：To investigate the antioxidant activity and the protective effect on liver of blueberry anthocyanins in type 2 diabetes mice. Type 2 diabetes mice model was induced by high-fat diet and small dose of alloxan. Fifty mices were separated into five groups：normal control group，model control group，positive control group（allox an），low-dose blueberry anthocyanins group（100 mg/kg·d）and high-dose blueberry anthocyanins group （200 mg/kg·d）. The positive control and blueberry anthocyanins group were administered once daily for 30 days. We detected the fasting blood sugar of mices，the level of glutathione peroxidase（GSH-PX），superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA），the morphological changes of liver tissues after 12 hours behind the last time administration. Compared with the control group，the fasting blood sugar of mice maintained a higher level in model control group（P<0.01），the activity of SOD and GSH-PX in blood serum and liver tissues decreased significantly（P<0.01）while MDA content increased obviously（P<0.01）. The liver cells in mice appeared pathological changes of denaturation，interstitial edema and inflammatory cell infiltration. Compared with the model control group，the blood sugar decreased obviously in positive control group（P<0.01）and blueberry anthocyanins group，the activity of SOD and GSH-PX increased（P<0.01）while MDA content decreased （P<0.01），the pathological changes of liver improved. Blueberry anthocyanins can relieve the oxidative damage of experimental type 2 diabetes mices，and had some protective effects on liver.

Key words：blueberry anthocyanins；type 2 diabetes mice；oxidative damage

收稿日期：2015-12-01

*通信作者:金瑛（1973—），女，教授，博士。

作者简介：李亚巍（1984—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：药物化学。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（21102055）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.002