运动联合膳食干预改善肥胖大鼠瘦素抵抗的可能机制——基于食欲调节因子基因启动子区DNA甲基化的探讨

陈 平，孙 剑

◀运动人体科学

运动联合膳食干预改善肥胖大鼠瘦素抵抗的可能机制
——基于食欲调节因子基因启动子区DNA甲基化的探讨

陈 平1，2，孙 剑3

（1.吕梁学院体育系，山西吕梁033000；2.北京师范大学体育与运动学院，北京100875；3.新疆师范大学体育学院，新疆乌鲁木齐830000）

目的：从基因启动子区DNA甲基化环节，探讨运动、膳食干预对瘦素抵抗大鼠血清瘦素、下丘脑瘦素受体表达的表观遗传调控机制。方法：130只SD大鼠随机分为空白对照组（n＝10）和建模组（n＝120），分别给予普通标准啮齿类动物饲料和高脂饲料喂养。后者在第8周时筛选出体重排序前1／3大鼠，并测量其血清瘦素水平，随机分为高脂膳食对照组（HFC）、高脂膳食运动组（HFE）、普通膳食运动组（HRE）、普通膳食对照组（HR）。各组大鼠分别给以中等强度的跑台运动干预或膳食干预8周。喂养周期结束后，禁食，麻醉状态下心脏取血、下丘脑组织。应用重亚硫酸盐修饰直接测序法（bisulfite sequencing-PCR，BSP）检测大鼠血清瘦素基因启动子区（324 bp，－228～＋96）25个CpG位点及下丘脑中瘦素受体基因启动子区（294 bp，－633～－345）20个CpG位点甲基化变化；同时采用酶联免疫吸附测定血清瘦素含量。结果：1）HFC血清瘦素水平显著高于C（P＜0.01）；HFE、HRE血清瘦素水平显著低于HFC（P＜0.05），且HRE显著低于HFE及HR（P＜0.01）；2）HFC血清瘦素基因启动子区CpG位点的平均甲基化程度显著低于C（P＜0.01）；HFE、HRE血清瘦素基因启动子区CpG位点的平均甲基化程度显著高于HFC（P＜0.05），且HRE血清瘦素基因启动子区CpG位点的平均甲基化程度显著高于HFE及HR（P＜0.01）；3）HFC下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点的平均甲基化程度显著高于C（P＜0.01），HFE、HRE下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点的平均甲基化程度显著低于HFC（P＜0.01），且HRE下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点的平均甲基化程度显著低于HFE及HR（P＜0.01）。结论：运动联合膳食干预较单独运动或膳食干预可以明显改善瘦素抵抗，其机制可能是与运动联合膳食干预上调血清瘦素基因启动子区CpG位点平均甲基化程度、下调下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点的平均甲基化程度有关。

运动；膳食；干预；瘦素抵抗；瘦素；瘦素受体

肥胖是世界各国面临的最重要的社会问题之一，由其引发的机体胰岛素抵抗、2型糖尿病、心血管疾病、动脉粥样硬化病、肿瘤等相关代谢性疾病对人类的健康及生存构成了极大的威胁［1］。目前研究认为，肥胖是由遗传、环境和心理行为因素共同作用的结果。但是，由于神经内分泌和代谢系统在机体能量平衡调节过程中的复杂性，使得肥胖的遗传、环境和心理行为等发病因素在肥胖形成过程中的作用不容易量化，特别是近年来儿童肥胖发病率的增加，使得之前的有关肥胖的病因学说很难完全解释肥胖这一现象［2］。最新的研究推测机体对某些疾病产生的易感性改变，或者机体在生长发育过程中引起功能基因组异常的长时程变化，可能是由于表观遗传修饰变化所介导的基因表达变化所致［3］。研究表明，表观遗传修饰是基因表达调控的重要作用机制之一，它是在基因DNA序列没有发生改变的情况下研究基因表达水平的变化，且这种变化是可以遗传和能够逆转的［4］。环境因素在表观遗传修饰改变方面起着非常重要的影响，它的轻微变化就可以改变代谢关键基因的表达水平，从而对整个代谢通路产生影响，进而将表观遗传学与后天环境造成的疾病紧密联系起来。近年来，表观遗传与肥胖的发生关系日益受到重视，并为肥胖的发病机制研究提供了新的方向。而与肥胖有关的表观遗传变化主要涉及DNA甲基化、核组蛋白修饰和mRNA对基因转录后水平的调控等［5］。而DNA甲基化修饰是表观遗传学最具特征的标志之一，且是目前研究的最为深入的表观遗传调控机制。其不仅仅能够影响到细胞基因的表达，而且还可以随着细胞的有丝分裂而遗传，并且持续下去。大量研究表明，运动、饮食控制在调控肥胖症、糖尿病等慢性代谢性疾病方面起着非常积极的作用，能够对机体内分泌功能、能量代谢以及基因的表达等产生许多重要的影响［6］。因此，本研究假设运动、膳食干预会对瘦素抵抗大鼠血清瘦素及下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化产生一定的影响，从表观遗传学角度探索膳食、运动在改善瘦素抵抗方面的分子机制，同时也为从表观遗传学角度防治代谢综合征提供新思路和依据。

1 材料与方法

1.1 肥胖模型的制备

选用鼠龄为7～8周SD健康雄性周龄大鼠130只［体重（200±20）g］，购于北京大学医学部实验动物中心（许可证号：SCXK（京）2006－0008）。高脂饲料配方由北京大学医学部实验动物科学中心提供，即由普通饲料加蔗糖、熟猪油、鸡蛋、奶粉混合烤熟而成，总热量为2080J／kg（蛋白质15%，碳水化合物51%，脂肪25%）。普通饲料由北京大学医学部实验动物科学中心提供，总热量为1 488 J／kg（蛋白质20%，碳水化合物53%，脂肪9%）。动物购置后，适应性喂养1周，参照随机号码表分成2组，即空白对照组（C组，n＝10）和高脂膳食模型组（H组，n＝120），体质量分别为（207.45±14.69）g和（209.58 ±15.83）g，各组间体重无差异（P＞0.05）。动物分笼饲养，每笼5只。室内温度（22±2）℃，相对湿度40%～60%。每日光照黑暗时间各为12 h，自由饮水、活动。正常组喂养普通饲料，肥胖组喂养高脂饲料。高脂饲料在低温环境下保存，给食前复温24 h。每周测体重一次，第8周时，筛选出建模组体重排序前1／3大鼠，与对照组比较体重、血清瘦素水平及判断肥胖程度的相对指标－Lee、s指数。Lee、s指数在实验末次干预结束后对大鼠称重，并准确测量从鼻至肛门的长度，并按公式［即Lee，s指数＝× 103／身长（cm）］计算获得。

实验第8周时，血清瘦素水平空白对照组与肥胖组分别为1.61±0.46和3.78±0.45（P＜0.01）；体重空白对照组与肥胖组分别为（474.31±14.77）g和（589.48±21.07）g（P＜0.01），Lee、s指数空白对照组与肥胖组分别为289.54±10.87和338.29± 11.46（P＜0.01），提示建模成功。建模成功后，高脂膳食建模组大鼠重新随机分组：高脂膳食对照组（HFC）、高脂膳食运动组（HFE）、普通膳食运动组（HRE）、普通膳食组（HR）及原有的空白对照组（C）。

1.2 运动干预方案

运动组采用跑台运动，运动训练方案参考陈文鹤、张靓等文献［7－8］制定。为了使大鼠逐渐适应运动强度，第一周为适应周，跑台速度逐渐增加直至达到26 m／min，持续时间为60 min，坡度为5%坡度。正式跑台训练的持续时间为8周，5次／周，60 min／次。训练时间在下午15点至18点期间进行。在运动实施前预实验中分别检测大鼠安静（2.3±0.4）mmol／L及运动后（3.7±0.6）mmol／L血乳酸值，提示属于中等强度有氧运动。

1.3 取材及组织准备

大鼠末次运动结束后，禁食24 h，称重，用10%水合氯醛（400 mg／kg）腹腔注射麻醉。经腹主动脉取血3 ml，离心取血清，－80℃保存待测。

动物处死后，即将大鼠断头，取脑组织。在4℃冰面上轻轻翻转脑组织，分离脑区，以灰结节和视交叉之间的中心点为中心确定下丘脑部位，取出下丘脑组织后迅速投入液氮中保存备用。

1.4 统计方法

采用SPSS 11.5统计软件包对数据资料进行统计分析，数值均数±标准差（¯X±S）表示。大鼠体重、Lee、s指数、血清瘦素浓度、CpG位点甲基化水平组间比较采用单因素方差分析中的Tukey法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

1.5 指标测定

1.5.1 体重、Lee指数、血清瘦素的测定 每周固定时间由专人称量大鼠的体重、测量鼻尖到大鼠肛门的长度，计算Lee指数；采用酶联免疫分析法（ELISA）测定血清瘦素水平。

1.5.2 基因启动子区CpG位点甲基化检测 对于瘦素、瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化改变，应用亚硫酸盐修饰直接测序法（bisulfite sequencing－PCR，BSP）检测。对于血清瘦素和下丘脑瘦素受体，分别用微量血液DNA提取试剂盒（北京博奥生物科技发展研究所生产）和细胞／组织基因提取试剂盒（北京博奥生物科技发展研究所生产）抽取外周血细胞中全基因组DNA和下丘脑组织中的全基因组DNA。然后，应用甲基化修饰试剂盒（美国EPIGENETEK公司生产）将所提取的DNA进行修饰纯化后，用于PCR反应。针对大鼠瘦素基因启动子区324 bp（从－228到＋96，包含28个CpG位点）、瘦素受体基因启动子区271 bp（从－411到－141，包含20个CpG位点）（具体CpG位点见图1），应用引物设计软件Primer 5.0设计引物序列（表1）。瘦素基因启动子区PCR反应条件：96℃，预变性时间10 min，96℃预变性1 min，退火温度57.4℃，持续时间1 min，延伸72℃持续min，循环35次。瘦素受体基因启动子区PCR反应条件：96℃预变性10 min，96℃变性1 min，退火温度63.5℃～59℃，持续1min（降低0.5℃／次），延伸72℃持续1min，进行10个循环；然后96℃变性1 min，退火温度58.5℃持续1 min，延伸72℃持续1 min，循环25次。最后对PCR产物进行鉴定、测序，计算CpG位点甲基化程度（图1～图2）。

2 结果

2.1 运动、膳食干预后各组大鼠体重、Lee指数、血清瘦素变化

干预后，相对于HFC，HFE和HRE大鼠体重、Lee指数、血清瘦素水平都具有显著差异（P＜0.01）；HR、HFC及HRC干预措施中，可以看出运动＋膳食干预措施效果较好。HRE大鼠这3项指标都显著低于HFE或HR（P＜0.05）。HRE大鼠血清瘦素水平显著低于HFC、HFE及HR（P＜0.01）；但各干预组血清瘦素水平依然高于C（P＜0.05）（表2）。

表1 引物序列、扩增长度及位点

图1 瘦素基因启动子序列（－228～＋96）

图2 瘦素受体基因启动子序列（－411～－141）

表2 干预后各组大鼠体重、Lee指数、血清瘦素的变化情况（¯X±S）

2.2 运动、膳食干预后各组大鼠血清瘦素、下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化

与C相比，HFC大鼠血清瘦素基因启动子区CpG位点甲基化水平显著降低（P＜0.01），下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化水平显著升高（P＜0.01）；干预后，相对于HFC，HFE大鼠血清瘦素基因启动子区CpG位点甲基化水平显著升高（P＜0.05），下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化水平显著降低（P＜0.05）；HRE大鼠血清瘦素基因启动子区CpG位点甲基化水平显著升高（P＜0.01），下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化水平显著降低（P＜0.01）；HR大鼠血清瘦素基因启动子区CpG位点甲基化水平升高，下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化水平降低，但均无统计学差异（P＞0.05）；相较于HR，HFE与HRE大鼠血清瘦素基因启动子区CpG位点甲基化水平显著升高（P＜0.01），下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化水平显著降低（P＜0.01）（表3、表4）。

表3 运动、膳食干预后各组大鼠血清瘦素基因启动子区CpG位点甲基化（¯X±S）

表4 运动、膳食干预后各组大鼠下丘脑瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化（¯X±S）

续表4

3 讨论

瘦素是肥胖基因表达的蛋白质类激素，主要由白色脂肪组织分泌入血，通过与其受体结合，在调节食欲和能量代谢方面发挥重要作用［9］。虽然瘦素受体在机体外周多种组织都有表达，但是，瘦素受体最重要的分布区域是在下丘脑，因此下丘脑被认为是最重要的能量代谢和平衡的调节中枢［10］。

3.1 肥胖与瘦素抵抗

研究表明，大多数肥胖患者体内都存在高瘦素水平，即瘦素抵抗现象［11］。但到目前为止，肥胖患者机体存在的瘦素抵抗现象的具体机制仍未得到阐明。大量研究表明，高瘦素血症、瘦素受体表达下调被认为是造成瘦素抵抗的众多原因之一［12］。大量动物实验表明，绝大多数先天肥胖的哺乳动物（除ob小鼠）和过量摄食导致的肥胖动物都有高瘦素血症，并对外源性瘦素表现出抵抗性；人类肥胖也不例外，研究表明，在人体内，血瘦素水平与体质含量、脂肪含量等呈正相关，大多数肥胖患者存在高瘦素血症［13］。本研究结果发现，经过8周高脂膳食喂养后，模型组大鼠较空白对照组大鼠血清瘦素浓度显著升高，提示模型组大鼠体内存在瘦素抵抗现象。模型组大鼠体内高瘦素水平的现象，可能是由于过多的热能摄入，导致大鼠体重增加，从而使机体大量脂肪组织沉积，进而造成脂源性的细胞因子瘦素水平的升高。另外，脂肪组织当中巨噬细胞的数量可以受到长期高脂膳食诱导的影响，会使其表达水平大量增加，从而导致机体处于一种炎症性状态，比如会使一些炎性细胞因子（白介素－6、肿瘤坏死因子－a）表达水平升高。这些炎性因子又会进一步刺激瘦素分泌，加重瘦素抵抗现象。随着机体内源性瘦素水平的进一步升高，机体可能会出于一种自身防御机制，对瘦素的敏感性降低，或存在瘦素受体及受体后缺陷，瘦素不再能发挥其正常的生理调节作用，从而使高脂膳食大鼠一直处于肥胖且伴瘦素抵抗状态。

3.2 饮食对大鼠血清瘦素、下丘脑瘦素受体基因启动子区DNA甲基化的影响

研究表明，饮食等诸多环境因素均可导致基因发生DNA甲基化的表观遗传修饰改变，进而导致基因表达及组织细胞的代谢变化［14］。研究表明，给怀孕时期小鼠或怀孕期的母亲饮食补充甲基供体（叶酸、维生素B12、大豆等）可以预防子代小鼠或人类后代肥胖的发生［15］。动物实验研究表明，与正常进食大鼠相比，高脂饲料诱导的肥胖大鼠血清瘦素浓度显著升高，而瘦素基因启动子区甲基化程度明显降低，存在瘦素抵抗现象［16］。临床研究显示，饮食干预效果好的肥胖患者外周血瘦素基因启动子区CpG位点甲基化水平较高，饮食干预效果差的肥胖患者外周血瘦素基因启动子区CpG位点甲基化水平较低［17］。本研究结果发现，高脂膳食大鼠血清瘦素基因启动子区甲基化程度显著降低，下丘脑瘦素受体基因启动子区甲基化程度显著升高，同时血清瘦素水平显著升高，伴随瘦素抵抗的现象；而经过膳食干预后，大鼠血清瘦素基因启动子区甲基化程度有升高趋势，下丘脑瘦素受体基因启动子区甲基化程度显著降低，伴随大鼠血清瘦素水平下降趋势，表明血清瘦素及下丘脑瘦素受体基因甲基化程度对瘦素抵抗产生了一定的影响。研究表明，DNA甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，其调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一［18］。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达［19］。本研究结果发现，血清瘦素及下丘脑瘦素受体基因的不同甲基化水平对瘦素抵抗具有积极的影响，可能是血清瘦素和下丘脑瘦素受体DNA不同甲基化水平，降低了血清瘦素基因活性，提高了下丘脑瘦素受体基因活性，从而使血清瘦素mRNA表达水平下调，下丘脑瘦素瘦素受体mRNA的表达水平上调，结果是导致血清瘦素表达水平降低和下丘脑瘦素受体表达水平升高所致。

3.3 运动对大鼠血清瘦素、下丘脑瘦素受体基因启动子区DNA甲基化的影响

有关运动对血清瘦素、下丘脑瘦素受体等食欲调节因子基因启动子区DNA甲基化的影响鲜见报道。但大量研究表明，耐力运动可对抗高脂膳食诱导的肥胖大鼠骨骼肌瘦素抵抗［20］；有氧运动可使肥胖青年女性血清瘦素水平显著降低［21］；有氧运动不仅能够有效地降低肥胖儿童的脂肪量，还能够使内分泌环境中各种代谢转导通路恢复稳定，改善机体的炎症反应和瘦素抵抗［22］；肥胖少年儿童经过4个月运动训练可使血清瘦素浓度显著降低，成年肥胖男性进行16个月耐力训练后，在不同时间点检测血瘦素水平发现，血瘦素水平降低且与训练时间相关［23］。另据研究发现，有氧运动可增加糖尿病大鼠瘦素受体的基因表达水平和蛋白表达水平，从而影响瘦素的水平，改善糖尿病大鼠胰岛素分泌，并缓解瘦素抵抗现象［24］。本研究结果表明，8周中等强度有氧运动可使高脂膳食运动组及普通膳食运动组大鼠血清瘦素基因启动子区DNA甲基化水平显著升高，下丘脑瘦素受体基因启动子区DNA甲基化水平显著降低，且普通膳食运动组大鼠血清瘦素、下丘脑瘦素受体基因启动子区DNA甲基化水平较高，脂膳食运动组变化更显著，并伴随血清瘦素水平的显著降低。提示运动可能通过影响大鼠血清瘦素、下丘脑瘦素受体DNA启动子区DNA甲基化修饰，从而通过降低血清瘦素mRNA的表达水平以及提高下丘脑瘦素受体mRNA的表达水平，导致血清瘦素浓度降低，缓解瘦素抵抗。

研究表明，运动联合膳食干预较单独运动或者膳食干预可以明显改善瘦素抵抗［7］。本研究结果进一步证实，较单纯运动或者膳食干预，运动联合膳食干预可以明显改善肥胖大鼠瘦素抵抗，体重显著降低。表明运动联合膳食干预在改善机体瘦素抵抗方面具有积极的作用。同时本研究结果发现，较单纯运动或者膳食干预，运动联合膳食干预可使大鼠血清瘦素基因启动子区甲基化程度显著升高，下丘脑瘦素受体基因启动子区甲基化程度显著降低。运动联合膳食干预可使肥胖大鼠瘦素抵抗现象得到显著的缓解，体重显著下降。

运动、膳食干预可能通过影响瘦素、瘦素受体基因启动子区甲基化程度而降低血清瘦素水平，从而对抗机体瘦素抵抗的发生，进而调节代谢和抑制食欲，对抗机体发生肥胖。至于运动、膳食干预影响瘦素基因启动子区甲基化改变的具体表观遗传调控机理，尚有待进一步探讨。

4 结论

1）高脂膳食可以导致大鼠血清瘦素基因启动子区甲基化水平下降，下丘脑瘦素受体基因启动子区甲基化水平升高。

2）运动联合膳食干预显著改善大鼠瘦素抵抗，可能与上调血清瘦素基因启动子区甲基化水平、下调下丘脑瘦素受体基因启动子区甲基化水平有关。

3）运动联合膳食干预可以通过影响基因启动子区甲基化水平改善瘦素抵抗，在预防和治疗肥胖症中可能起到一定的作用；但运动联合膳食干预影响瘦素基因启动子区甲基化改变的具体表观遗传调控机理，尚有待进一步探讨。

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责任编辑：郭长寿

Possib le M echanism of Exercise Combined w ith Dietary Intervention to Im p rove Lep tin Resistance in Obese Rats：In View of Appetite Regulating Factor Gene Prom oter DNA M ethylation Investigation

CHEN Ping1，2，SUN Jian3
（1.Department of Physical Education，Lüliang University，Lüliang 033000，Shanxi，China；2.Department of Physical Education and Sports，Beijing Normal University，Beijing 100875，China；3.Department of Physical Education，Xinjiang Normal University，Urumqi830000，Xinjiang，China）

objective：From promoter DNA methylation links of the gene，the authors explore themovement，dietary intervention on leptin resistance expression of leptin receptor in hypothalamus of rats serum leptin and epigenetic regulationmechanism.Methods：130 SD rats were random ly divided into blank control group（n＝10）and model group（n＝120），and were given routine standard rodent animal feed and high fat diet.After8 weeks，1／3 of the ratswhoseweightwere heavier in themodeling group were screened out，measured for the serum leptin level and were random ly divided into control group，high fat diet（HFC），high fat diet and exercise group（HFE），sport in ordinary diet group（HRE），normal diet control group（HR）.The ratswere treated w ithmoderate intensity treadm ill exercise intervention or dietary intervention for 12 weeks.A fter the end of the cycle，fasting，anesthesi，heart blood，hypothalamus.Application of sulfitemodified direct sequencing（bisulfite sequencing-PCR，BSP）were detected in plasma leptin gene promoter region（324 bp，－228～＋96）leptin receptor gene promoter region of 25 CpG loci and the hypothalamus（294 bp，－633～－345）of 20 CpG locimethylation changes；at the same time by ELISA determ ination of plasma leptin level adsorption.Results：1）HFC serum leptin levelsw ere significantly higher than those of C（P＜0.01）；the serum leptin levels of HRE and HFE were significantly lower than those of HFC（P＜0.05），and HRE were significantly lower than those of HFE and HR（P＜0.01）.2）the averagemethylation degree of HFC in serum leptin gene promoter CpG siteswas significantly lower than thatof C（P＜0.01）；the average methylation the degree of HFE，HRE and serum leptin gene promoter CpG sites was significantly higher than thatof HFC（P＜0.05），the averagemethylation level of serum leptin and HRE gene promoter CpG siteswas significantly higher than that of HFE and HR（P＜0.01）.3）the average methy lation level of HFC and leptin receptor gene promoter CpG siteswas significantly higher than that of C（P＜0.01），the averagemethylation level of HFE，HRE and leptin receptor gene promoter CpG siteswas significantly lower than that of HFC（P＜0.01）and the averagemethylation level of HRE in the hypothalam ic leptin receptor gene promoter CpG siteswas significantly reduced than those of HR and HFE（P＜0.01）.Conclusion：exercise combined w ith dietary intervention can obviously improve leptin resistance more than single exercise or dietary intervention，and itsmechanism may be associated with themovementof dietary intervention serum leptin up-regulated gene promoter CpG sites average methylation level and the average methylation level dow n-regulation of leptin receptor in the hypothalamus gene promoter CpG sites.

exercise；diet；intervention；leptin resistance；leptin；leptin receptor

G804.3

A

1004－0560（2016）03－0066－08

2016-03-27；

2016-04-19

教育部人文社会科学研究青年基金项目，编号：13YJC890032。

陈 平（1983—），男，博士研究生，主要研究方向为体育保健与运动营养。

孙 剑（1978—），男，副教授，主要研究方向为运动生理学，E-mail：315339318＠qq.com。