夏枯草提取物对Jurkat淋巴瘤细胞凋亡影响的体外实验研究

马耀臻，孙振昌，付晓瑞，兰　宣，张明智

(郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052)



夏枯草提取物对Jurkat淋巴瘤细胞凋亡影响的体外实验研究

马耀臻，孙振昌，付晓瑞，兰宣，张明智

(郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南 郑州 450052)

[摘要]目的探讨夏枯草提取物对Jurkat细胞凋亡的影响。方法琼脂糖凝胶电泳法检测Jurkat细胞发生的DNA降解；流式细胞仪分析Jurkat细胞经不同浓度夏枯草提取物处理48 h后的细胞凋亡率。结果DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示：各实验组出现明显的DNA梯形凋亡条带，而空白对照组无DNA梯形凋亡条带出现；流式细胞Annexin V/PI法检测细胞凋亡：夏枯草提取物(18 μg·mL(-1)、26 μg·mL(-1)、34 μg·mL(-1))处理Jurkat细胞48 h后，凋亡早期细胞在空白对照组占3.07%，在18 μg·mL(-1)组占7.58%，在26 μg·mL(-1)组占19.39%，在34 μg·mL(-1)组占34.16%。结论夏枯草提取物能够诱导Jurkat细胞的凋亡。

[关键词]夏枯草；淋巴瘤；Jurkat细胞；细胞凋亡

淋巴瘤发病率逐年上升，以化疗为主的综合治疗仍是目前治疗淋巴瘤的主要手段，迄今用于临床的化疗药物毒副反应较重，尤其是对骨髓造血功能的抑制作用常常会导致化疗中断，而原发或继发耐药往往导致化疗失败。

因此，寻求高效低毒的抗肿瘤药物是目前肿瘤治疗的主要研究内容之一。夏枯草作为一种传统的中草药，具有清火明目、软坚散结之功效。有关其抗肿瘤作用有较多的报道，如应用夏枯草治疗甲状腺癌、淋巴肉瘤、腮腺癌、扁桃腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌等由来已久。现代药理学研究证明夏枯草具有广泛的药理活性。在体外肿瘤细胞凋亡实验中提示该药能诱导人胃癌SGC-7901细胞、小鼠T淋巴瘤EL-4细胞及人红白血病K562细胞的凋亡[1]。但是，夏枯草抗肿瘤有效提取物的抗肿瘤作用机制有待进一步深入研究。

1材料与方法

1.1细胞株人T淋巴瘤Jurkat细胞，购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。

1.2药物与试剂夏枯草(产地：河南确山，提取物由郑州大学药学院提取)干燥成熟果穗经醇煎及一系列萃取、蒸馏、干燥等过程提取而成等；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(天津TBD血液研究所)；磷脂结合蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(propidine iodide，PI)凋亡检测试剂盒(美国Bender MedSystems公司)。

1.3主要仪器96孔培养板(美国Costar公司)，微量移液器(芬兰Biohit公司)，超净工作台(苏州净化设备厂)，DG5031型酶联免疫检测仪(南京华东电子医疗装备有限责任公司)，DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，U-2001型紫外分光光度仪(美国Startorius公司)，PAS型流式细胞仪(德国Partec公司)。

2方法

2.1夏枯草提取物对Jurkat细胞影响的片段化分析

2.1.1提取DNA收集夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)及生理盐水处理48 h后的Jurkat细胞，UNIQ-10柱提取基因组DNA[2]。

2.1.2琼脂糖凝胶电泳用1×TBE缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，加入10 mg·mL-1溴化乙啶制胶，取DNA样品7 μL与上样缓冲液按5:1混匀后电泳(恒压55 V，1 h)，成像系统分析并拍照。

2.2流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡

2.2.1实验分组实验组：不同浓度夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)处理48 h后的Jurkat细胞。对照组：加入等体积的生理盐水。

2.2.2制备单细胞悬液取不同组别Jurkat细胞经流式细胞仪检测。流式细胞仪测定细胞凋亡的结果判定：凡细胞出现细胞膜受损，且Annexin V(+)/PI(-)的细胞为早期凋亡细胞，Annexin V(+)/PI(+)的细胞为晚期凋亡细胞或坏死细胞；Annexin V(-)/PI(-)细胞为正常细胞；Annexin V(-)/PI(+)为坏死细胞。细胞凋亡率=Annexin V(+)/PI(-)细胞数+ Annexin V(+)/PI(+)细胞数/检测细胞数×100%。

2.2.3流式细胞仪分析单染PI法使用单通道620 nm绿色荧光检测细胞，双染Annexin V/PI法分别以525 nm、620 nm红色荧光和绿色荧光检测细胞，经流式细胞仪的Partec FloMaX测量软件检测每个样品20 000个细胞。单染PI法采用Partec FloMaX软件分析20 000个细胞中凋亡细胞所占的比率。双染Annexin V/PI法直接测得每个样本20 000个细胞中正常细胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡细胞所占的比例。

2.3统计学处理用SPSS 17.0处理相关数据，计数资料采用百分数表示，比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1夏枯草提取物诱导Jurkat 细胞凋亡的作用不同浓度的夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)处理Jurkat细胞48 h后引起细胞凋亡，DNA琼脂糖凝胶电泳出现明显的DNA梯形凋亡条带(DNA ladder band)，提示DNA在核小体间断裂，呈细胞凋亡的典型特征，而培养时间相同的空白对照组无DNA梯形凋亡条带出现。见图1。

图1　不同浓度夏枯草提取物

1：加药34 μg·mL-1组，DNA加样量7 μL；2：加药26 μg·mL-1组，DNA加样量7 μL；3：加药18 μg·mL-1组，DNA加样量7 μL；4：空白对照组，DNA加样量7 μL

2.2夏枯草提取物处理Jurkat细胞48 h后流式细胞仪检测细胞凋亡将Annexin V与PI匹配使用，利用流式细胞仪分别检测不同浓度的夏枯草提取物作用于Jurkat细胞在48 h后的凋亡百分率。1)活细胞在空白对照组占91.23%；在18 μg·mL-1组占88.25%；在26 μg·mL-1组占47.04%；在34 μg·mL-1组占10.52%。随着作用浓度的增加，活细胞数量逐渐减少。26 μg·mL-1和34 μg·mL-1组与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；2)凋亡早期细胞在空白对照组占3.07%；在18 μg·mL-1组占7.58%；在26 μg·mL-1组占19.39%；在34 μg·mL-1组占34.16%。随着作用浓度的增加，凋亡细胞数量增加。26 μg·mL-1和34 μg·mL-1组与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2、表1。

图2　夏枯草提取物处理Jurkat细胞不同浓度的细胞凋亡率变化

%

注：26 μg·mL-1组、34 μg·mL-1组与空白对照组比较，P<0.05；各实验组两两比较，P均<0.05

3讨论

诱导细胞凋亡是目前研究最为热点的中草药抗肿瘤机制。越来越多的研究[1-2]表明，中草药抗肿瘤的疗效与中草药诱导肿瘤细胞凋亡有关。细胞凋亡是一种有别于细胞坏死的，细胞主动参与并遵循一定程序的自我消亡过程，是多细胞有机体为调控有机体发育，维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程[3-4]。有学者认为细胞凋亡又称程序性死亡，但严格说来，两者不是指的同一现象，程序性死亡是功能上的概念，凋亡是形态上的概念，并不是所有的程序性死亡都表现为细胞凋亡的形态学特征[5]。细胞凋亡不仅对胚胎发生、器官发育、变态反应及保持机体自稳等过程至关重要，而且通过细胞凋亡，机体能及时清除过多的、受损的或恶变的细胞。正常的细胞凋亡被抑制，可能是各种恶性肿瘤和自身免疫性疾病的重要发病机制。细胞凋亡具有特殊的形态和生化特征。形态学特点表现为：首先是胞体缩小，失去微绒毛，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜表面，形成新月形致密小斑块；接着染色体断裂，核膜和细胞膜均内陷，自行分割为多个外有膜包裹、内含物不外溢的凋亡小体，最终被邻近细胞所识别、吞噬。

研究细胞凋亡的方法有很多。形态学观察是检测细胞凋亡最可靠的方法，主要是通过光学显微镜和电子显微镜，对组织或细胞进行各种染色，如HE染色、甲基绿-呱诺宁染色、Giemas染色等。在普通光学显微镜下常用荧光染料如叮咙橙、Heochst33258染色在荧光显微镜下观察;或制成超薄切片用电子显微镜观察，以区别细胞凋亡和坏死。但这些传统的方法仅局限在大体形态上，远不能胜任精确的定性、定量，因此，限制了其应用。

而其他的凋亡生化特征的检测方法有：TUNEL检测法、ELISA检测法、DNA凝胶电泳法、Annexin V与PI双染检测细胞凋亡法。1)TUNEL检测法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞和早期凋亡，缺点是因需固定细胞可出现DNA片段丢失；2)DNA凝胶电泳法的原理是凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别，缺点是定量较困难；3)ELISA检测法敏感性高，可检测5～100 ·mL-1个凋亡细胞，不需要特殊仪器，操作方便，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝对量；4)Annexin V与PI双染检测细胞凋亡法的原理是细胞在正常生存状态下，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。PI是一种核酸染料，其不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的Annexin V对细胞染色，可使早期凋亡细胞膜外表面暴露的PS于Annexin V/FITC特异性结合而出现绿色荧光，但细胞仍维持其细胞膜的完整性，使变性染色质着色的荧光染料PI不能进入细胞，然而坏死或凋亡晚期的继发性坏死细胞可同时受Annexin V和PI标记，借助流式细胞仪可定量分析受标记的凋亡坏死细胞数。此方法不需固定细胞，因此，操作方便，更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡定性与定量的方法。

本研究中，DNA琼脂糖凝胶电泳显示，不同浓度的夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 g·mL-1、34 μg·mL-1)作用于Jurkat细胞48 h后引起细胞凋亡，电泳可见明显的DNA梯形凋亡条带，且随药物浓度的增加，凋亡带逐渐变宽，而空白对照组无DNA梯形凋亡条带出现。不同浓度夏枯草提取物(18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1)作用Jurkat细胞48 h后，细胞凋亡率逐渐升高，呈剂量依赖性。其中18 μg·mL-1、26 μg·mL-1、34 μg·mL-1组活细胞分别为88.25%、47.04%、10.52%；早期细胞凋亡率分别为7.58%、19.39%、34.16%，26 μg·mL-1组和34 μg·mL-1组与空白对照组比较差异均有统计学意义。

上述结果提示，夏枯草提取物可诱导Jurkat细胞凋亡，这可能是其抗肿瘤作用机制。

参考文献：

[1]张明智,郑晓珂,刘宏民.夏枯草提取物体外诱导EL-4细胞凋亡的实验研究[J].江苏中医药,2008,40(4):80-83.

[2]孙振昌,付晓瑞,崔莹莹,等.夏枯草提取物作用Jurkat细胞的分子生物学研究[J].中药材，2014，37(8)：1441-1444.

[3]刘新奎,王琳,张明智.JNK和Caspase-3在夏枯草引起人淋巴瘤细胞凋亡中的作用[J].中华医学杂志,2010,90(10):690-693.

[4]张明智,孙振昌,付晓瑞,等.夏枯草提取物作用Jurkat细胞的蛋白质组学研究[J] .中药材，2009，32(6)：917-922.

[5]付晓瑞，孙振昌，张明智.夏枯草提取物诱导B、T淋巴瘤细胞凋亡的实验研究[J].中药材，2012，35(3)：433-438.

Effects of Selfheal Extract on Jurkat Cell Apoptosis

Ma Yaozhen, Sun Zhenchang, Fu Xiaorui, Lan Xuan, Zhang Mingzhi

(DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of selfheal extract on Jurkat cell apoptosis.MethodsDetect the DNA degradation of Jurkat cells exposured to different concentration of selfheal extract through agarose gel electrophoresis and analyze cell apoptosis rate by flow cytometry after 48 hours.ResultsAgarose gel electrophoresis of the DNA showed typical DNA ladder in the experimental groups, which wasn’t observed in the blank control group; Annexin V/PI by flow cytometry to detect cell apoptosis revealed that early apoptosis cells rate of Jurkat cells exposured to selfheal extract with the concentration of 18 μg·mL(-1), 26 μg·mL(-1), 34 μg·mL(-1) accounted for 7.58%,19.39%,34.16% respectively compared with 3.07% in the blank control group after 48 hours.ConclusionThe selfheal extract can induce the apoptosis of Jurkat cells.

[Key words]selfheal; lymphoma; Jurkat cells; cell apoptosis

(收稿日期：2015-10-12)

[中图分类号]R733.1；R730.23

[文献标识码]A

[文章编号]1673-5412(2016)02-0106-04

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2016.02.004

作者简介：马耀臻(1990-)，男，硕士，主要从事淋巴瘤的基础与临床研究。通信作者：张明智(1962-)，男，教授，主任医师，博士生导师，主要从事淋巴瘤的基础与临床研究。E-mail：mingzhi_zhang@126.com