DNA粗提取与鉴定实验中的一些技巧

倪莹莹

高中生物新课程选修（1）专题（5）DNA和蛋白质技术中有DNA的粗提取与鉴定这个实验，在做这个实验时，好多老师都认为该实验繁琐、复杂，做不做无所谓，有的用光盘给学生看一下实验过程或简单讲一下就算过去了.我却不这样认为，我觉得这个实验一定要让学生做，而且必须认认真真踏踏实实地做，只有通过做这个实验学生才能明白，了解课堂上老师所讲生物的遗传物质究竟是怎样一种物质，具有什么特点等.

一、实验前相关溶液的配备

1.鸡血细胞液的配制：取质量浓度为0，1 g/mL的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）100 mL，置于500 mL烧杯中.将宰杀活鸡流出的鸡血（约180 mL）注入烧杯中，同时用玻棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血.此实验，由于班级较多，需要的鸡血细胞液量大，可将配好的柠檬酸钠溶液放在塑料桶中，带到宰鸡场等血，再由于每只鸡血量不等，而且宰鸡场杀鸡的速度快，因此柠檬酸钠溶液与鸡血的比例可由原来的100∶180提升到1∶1，用一只500 mL的塑料烧杯（注：盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器.鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少.因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程中DNA的损失.）按1∶1快速采集鸡血，注意的是要先加抗凝剂，再加鸡血，而且一定要搅拌.采集好的鸡血然后集中到一个大的塑料桶中.回到学校，再分放在几个的塑料烧杯中，放入冰箱内静置一天，使血细胞自行沉淀，然后倒去上清液，即可得到所需的鸡血细胞液.（一般不用离心机，一方面离心机对离心管所装血液质量要求较高，另一方面由于当天采血当天做实验的班级较多，时间较为仓促）.

（2） 95%酒精溶液的配制（在实验前放入冰箱内冷却24小时）

（3）氯化钠的物质的量的浓度分别为2 mol/L和0.015 mol/L的溶液

（4）二苯胺试剂的配制：1克二苯胺加入100 mL冰醋酸+2.75 mL浓H2SO4，放在冰箱内，可视班级多少酌量配制.

二、与学生共同探讨清楚，该实验原理

1.DNA高盐中溶解，低盐中析出：DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的.当氯化钠的物质的量浓度为0.14 mol/L，DNA的溶解度最低.利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出.

2.用酒精去除杂质，而得到较纯的DNA：DNA不溶于酒清溶液，但是细胞中某些物质则可以溶于酒精溶液.利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA.

3.二苯胺显色鉴定DNA：DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此， 二苯胺可以用为鉴定DNA的试剂.

三、正确理解各实验操作要点及原理

1.低渗搅拌破碎血细胞，释放DNA：将制备好的鸡血细胞液5 mL～10 mL，注入到50 mL烧杯中.向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂.（注：蒸馏水对于鸡血细胞来说，是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞破裂，同时，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂，即细胞膜和核膜的破裂，于是释放出DNA.）然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500 mL的烧杯中，取其滤液.

2.高盐溶解DNA：将氯化钠的物质的量浓度为2 mol/L的溶液40 mL加入到滤液中，用玻棒沿一个方向搅拌1 min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态.

3.低盐DNA析出：沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物（DNA）出现，注意观察丝状物呈什么颜色.继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多.当加入的蒸馏水使氯化钠的浓度达到DNA的溶解度的最低点0.14 mol/L，粘稠物不再增加，这时停止加入蒸馏水，（注入蒸馏水约300 mL左右）

4.滤出DNA，DNA高盐再溶解，再过滤：用多层纱布过滤，使DNA的粘稠物留在纱布上，取一个50 mL的烧杯，向烧杯内注入物质的量为2 mol/L的氯化钠溶液20 mL，用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，（注：如果粘稠物不容易取，可将有粘稠物的纱布面反过来浸在2 mol/L的氯化钠溶液中，用镊子轻轻地拔下粘稠物，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中.）

5.冷却酒精漂洗，DNA析出：在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95%的溶液50 mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物.用玻棒将丝状物卷起，（玻棒对DNA有吸附作用）并用滤纸吸取上面的水分.这种丝状物的主要成分就是DNA.注意观察丝状物是什么颜色的.

6.DNA显色鉴定：取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量溶液为0.015 mol/L的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解.（如果丝状物不溶解，可直接将缠有丝状物的玻棒放在试管中）然后，向两支试管中各加4 mL的二苯胺试剂.混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化.

四、实验注意

1.低渗破碎要彻底，搅拌只能朝一个方向，搅拌要快.

2.过滤要细致，由于血液粘稠度高，不易过滤.可将纱布四周拢起，用玻棒轻轻的按.

3.低盐DNA析出，加入蒸馏水搅拌要慢.

该实验一般需要两节课时间，学生一边实验，一边思考（整个实验过程融会贯通，不能机械地跟着步骤走），有些同学在实验中会因为某些原因而失败，教师要鼓励他们再试一遍，找出原因.让他们面对失败不急不躁，沉着耐心，反复操作.当DNA和二苯胺在沸水中溶液颜色逐渐变蓝，即是学生享受成功喜悦之时.