瓜实蝇DNA甲基化的MSAP体系建立与优化

龚治 周世豪 马华博 张亚楠 符悦冠

摘 要 瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae （Coquillett）]是中国重要的蔬菜害虫，但其DNA甲基化研究尚未见报道。甲基化敏感扩增多态性是研究DNA甲基化的重要技术之一。通过对酶切反应、连接、PCR扩增和引物筛选等条件优化，建立瓜实蝇MSAP反应体系，即：①20 μL酶切体系中加入10 U的限制性内切酶与600 ng基因组DNA，于37℃酶切反应过夜；②20 μL连接体系中加入T4 连接酶1 U，HpaⅡ-MspⅠ-adapter接头50 pmol，EcoR I-adapter接头5 pmol，并于16℃反应12 h；③连接产物稀释后进行PCR预扩增和选择性扩增，再经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测结果。通过该体系筛选出适用于瓜实蝇基因组DNA甲基化多态性研究的6对引物；瓜实蝇MSAP体系为瓜实蝇的表观遗传学研究提供了技术支持。

关键词 瓜实蝇 ；DNA甲基化 ；甲基化敏感扩增多态性 ；表观遗传

中图分类号 S186 ；Q963 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.008

Abstract The melon fly [Bactrocera cucurbitae （Coquillett）] is one of the most important vegetables insect pest in China. However， the DNA methylation in melon fly has not been reported yet. Methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP） is an important research tecnnique to analysis the DNA methylation. The MSAP can be established through the enzyme digestion reaction， ligation， PCR amplification system， and primer screening， such as 10 U restriction endonuclease is put in the 20 μL enzyme digestion system， and then react with 600 ng of genome DNA at 37℃ overnight； 1U of T4 ligase is put in the 20 μL ligation system， 50 pmol of HpaⅡ-MspⅠ-adapter and 5 pmol of EcoR I-adapter which react at 16℃ for 12 hours. Diluent ligation products were used in PCR to pre-amplification and selected amplification， the result is tested by silver staining and 6% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Six pairs of primers which suited for DNA methylation sensitive amplified polymorphism were selected out by this system. The MSAP system provides the technical support for the study of the epigenetics research of melon fly.

Keywords Bactrocera cucurbitae （Coquillett） ； DNA methylation ； Methylation sensitive amplified polymorphism， MSAP ； epigenetics

瓜实蝇[Bactrocera cucurbitae （Coquillett）]属双翅目（Diptera）实蝇科（Tephritidae），是世界性检疫害虫[1-2]，主要为害葫芦科（Cucurbitaceae）和茄科（Solanaceae）植物，如甜瓜（Cucumis melo L.）、南瓜（Cucurbita moschata Duchesne.）、辣椒（Capsicum annuum L.）、苦瓜（Momordica charantia Linn.）、西瓜（Citrullus lanatus Thunb.）、无花果（Ficus carica Linn.）、番石榴（Psidium guajava Linn.）等[3-4]。瓜实蝇广泛分布于亚热带30多个国家和地区[2]，在中国主要分布于南方，包括江苏、福建、四川、湖南、台湾等地[5]，是中国南方发生实蝇中的优势种，每年给中国南方果蔬生产造成重大经济损失[6]。

当前，国内外学者对瓜实蝇的分布、寄主、危害程度、生物学、生态学、生理生化及综合防治等进行了大量研究[5，7]。然而瓜实蝇DNA甲基化及其基因表达调控等研究鲜有报道。甲基化敏感扩增多态性（Methylation sensitive amplified polymorphism， MSAP）是研究DNA甲基化的重要方法之一，不仅能够检测基因组DNA甲基化位点的水平和模式，操作相对便捷，分析结果能够直接与基因序列联系起来，而且具有敏感性强、检出位点多等特点，成为检测基因组DNA甲基化的重要方法[8-9]。在中国，MSAP技术已应用于橡胶树新品种选育[10]、果蝇基因组甲基化[11]、白背飞虱性别和翅型分化[12]等方面的研究。MSAP及其DNA甲基化已逐渐成为昆虫研究领域的新热点[13]。本研究以瓜实蝇为材料，建立和优化MSAP分析技术体系，为不同条件下瓜实蝇基因组DNA甲基化多态性位点的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实蝇

实验中所使用的瓜实蝇为羽化后2～3 d的饲养多代的室内种群。

1.1.2 试剂

E.Z.N.A.TM Insect DNA kit购自Omega Bio-tek公司；EcoRⅠ，MspⅠ，HpaⅡ，T4 DNA Ligase均为NEB产品；剥离硅烷、亲和硅烷购自北京鼎国生物工程公司；PCR相关试剂购自北京全式金生物技术有限公司；硝酸银购自上海生工生物工程技术有限公司；尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED为BBI公司进口分装药品；其它试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

按照Insect DNA Kit试剂盒推荐的方法提取基因组DNA。提取的DNA经过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并经紫外分光光度测定A260与A280值，并以此计算DNA的纯度和浓度。DNA于-20℃保存待用。

1.2.2 酶切

选用HapⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ 2组内切酶分别对基因组DNA进行酶切。20 μL体系中，先加入15 μL ddH2O，再加入2 μL 10×NEB Buffer，浓度为300 ng/μL的模板DNA 2 μL，最后加入EcoRⅠ，HapⅡ或MspⅠ，酶的用量分别设置为：2、4、6、8、10 U。混匀后放入低温循环水浴仪中，于37 ℃下进行双酶切1.0 h。之后选用最佳酶用量，分别进行2.0、4.0、6.0、12.0 h等不同酶切时间，完成后用2%琼脂糖凝胶检测酶切产物。

1.2.3 连接

取等量接头引物对混合，并于95℃加热5 min，然后缓慢冷却至室温，在室温下放置10 min制成接头待用。连接体系为20 μL，将接头等直接加入酶切液中，16℃连接12 h。接头在加入酶切液之前先合为双链（95℃ 5 min）。反应体系中加入双酶切液8.0 μL，10 ×T4 Buffer 2 μL，T4 连接酶各1.0 μL，接头引物Eco RⅠ-adapter、MspⅠ-adapter的反应终浓度分别设定为25、50、75 pmol/μL，混匀后放入低温循环水浴仪中进行连接。研究中所用到的接头、引物见表1。

1.2.4 预扩增

对连接产物分别进行10倍、20倍、30倍稀释，然后取2.5 μL用于预扩增反应。整个PCR反应体系为25 μL，其中2×Eco Taq PCR SuperMix 12.5 μL，预扩增引物各1 μL（浓度为10 μmol/L）。预扩增引物间进行正交配对。PCR程序为：95℃变性3 min 后，按以下参数扩增35 个循环：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，最后72℃延伸10 min，10℃保温。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析系统观察电泳结果。剩余产物保存至-20℃冰箱保存备用。

1.2.5 选择性扩增

对预扩增产物分别进行10倍、20倍、30倍稀释，然后取5 μL用于选择性扩增反应。整个PCR反应体系为25 μL，其中2×Eco Taq PCR SuperMix 12.5 μL，选择性扩增引物各3 μL（浓度为10 μmol/L）。选择性扩增引物间进行正交配对。PCR程序为：95℃变性3 min 后；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，35 个循环；72℃延伸10 min，10℃保温。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析系统观察电泳结果。剩余产物保存至-20℃冰箱保存备用。

1.2.6 引物筛选

采用优化后的AFLP体系对16对选择性扩增引物进行筛选。扩增产物取5 μL 与3 μL loading buffer 混匀，95 ℃变性5 min，转至冰浴中冷却，取3 μL上样，6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h，银染参照文献等[14]方法。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA 提取结果

瓜实蝇基因组DNA电泳图见图1。由图1可以看出，提取的基因组DNA主带清晰无降解，无RNA污染。而由表2可知，所提取的瓜实蝇基因组DNA的OD值均在1.7～1.9，说明DNA纯度较高，能够满足MSAP试验要求。

2.2 酶切反应体系

用不同量的HapⅡ/Eco RⅠ和MspⅠ/Eco RⅠ 2组内切酶分别对基因组DNA进行酶切，并于37℃下酶切1 h后，其产物用2%琼脂糖凝胶进行检测。由图2不同酶量的产物电泳图可看出，10 U组的酶切效果最好，而其它各组仍然依稀可见基因组DNA。而酶切时间的筛选结果（图3）可以看出，不同酶切时间均能对基因组DNA进行一定程度的消化，但12 h 处理中，4、4泳道内呈弥散状且带形整齐，表明酶切完全，其酶切效果优于其它3组处理。故确定合适的酶切反应条件为10 U用量的酶，于37℃反应12 h。

2.3 预扩增

图4是不同引物对和不同稀释倍数的预扩增产物电泳图。由图4可以看出，根据电泳条带的强弱、范围及杂带的多少进行直观分析。不同处理之间，由于连接产物稀释浓度、预扩增引物的不同，扩增结果存在显著差异。引物组合Eco RA-HpaⅡ-MspⅠC、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠT、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠC、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠG、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠC、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠG、Eco RC-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RC-HpaⅡ-MspⅠT、Eco RC-HpaⅡ-MspⅠC以及Eco RC-HpaⅡ-MspⅠG的扩增效果差，均出现了较为明显的条带，说明这些引物的扩增效果不理想，不利于后续的实验筛选。对引物组合Eco RA-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RA-HpaⅡ-MspⅠT、Eco RA-HpaⅡ-MspⅠG、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠT进行比较，引物对Eco RA-HpaⅡ-MspⅠG的扩增效果最好，主带主要集中在200～300 bp，且连接产物稀释30倍的扩增效果优于稀释10倍和20倍。因此选择引物对Eco RA-HpaⅡ-MspⅠG组且连接产物稀释30倍为最佳组合。

2.4 选择性扩增与银染结果

根据预试验的初步筛选，采用Eco R-AN和HpaⅡ-MspⅠ-GN选择性扩增引物进行选择性扩增（图5、6）。由图5可以看出，16个组合均扩增出条带。将16对不同引物组合的选择性扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染第2次筛选（图6），所有引物均能扩增出条带。结合2次筛选结果，选取条带清晰，多态性好的引物组合共6对，分别是：Eco R-AG和HpaⅡ-MspⅠ-GA，Eco R-AG和HpaⅡ-MspⅠ-GG，Eco R-AC和HpaⅡ-MspⅠ-GC，Eco R-AC和HpaⅡ-MspⅠ-GA，Eco R-AC和HpaⅡ-MspI-GT，Eco R-AC和HpaⅡ-MspⅠ-GG。

3 讨论

本研究通过对MSAP反应的酶切、连接、PCR扩增和引物筛选等条件的优化，建立了瓜实蝇DNA甲基化多态性检测的技术体系，为后续瓜实蝇的环境适应机制研究提供了技术支撑。MSAP因其使用的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ对相同序列CCGG中甲基化修饰的敏感程度不同，导致HpaⅡ/Eco RⅠ和MspⅠ/Eco RⅠ 2种酶切结果经扩增产生条带的多态性，CCGG的甲基化修饰水平可以通过PAGE电泳谱带的差异进行分析。因此，酶切反应的质量是关系着MSAP分析成果的关键步骤。酶切不完全会造成甲基化分析的不完全，而酶切过度会产生非特异性片段，导致阳性甲基化片段。这些都会在一定程度上影响MSAP分析效果。此外，在MSAP分析过程中的2个PCR反应，模板浓度以及缓冲液的量是决定扩增反应是否成功的关键所在，模板稀释浓度太大或太小都会影响实验结果，稀释浓度过大会发生拖尾现象，稀释浓度过小条带无法正常显现分析。而缓冲液的量决定着PCR反应中扩增酶能否正常的发挥，缓冲液过大或过小都会影响酶活性。

HpaⅡ可以识别并切割非甲基化和单链甲基化（mCCGG/GGCCh或mCmCGG/GGCC）；而MspⅠ能识别并切割非甲基化和内侧甲基化位点（CmCGG/GGCC或CmCGG/GGmCC）而不能切割外侧甲基化位点[15]。因此，MSAP技术在一定程度上也有局限性。陆光远[16]在对油菜的研究中提到MSAP技术检出的DNA胞嘧啶甲基化是基于“CCGG/GGCC”序列，而“CCGG/GGCC”位点之外的胞嘧啶序列是否进行了修饰不在该方法检测之内，但因为90%左右的胞嘧啶甲基化修饰发生在“CpG”二核苷酸或“CpNpG”三核苷酸区域内，因此，基于“CCGG/GGCC”序列研究基因组DNA或基因胞嘧啶甲基化修饰的MSAP是能够在一定程度上反应物种基因组甲基化修饰水平的[17]。另外，MSAP技术是基于AFLP技术发展而来，故还具有以下多方面的优势[18]：（1）可以用于研究非模式生物，甚至包括那些缺少基因组测序的物种。（2）该技术具有较好的成本效益，较容易按比例增加，而且相同的试剂能够用于不同的物种研究。（3）可以在多个位点对大量个体进行批量筛选，从而产生大量的数据来检测种群和处理中发生的突变与分化。（4）该技术对环境诱导的DNA甲基化变异的检测灵敏度高。因此，尽管MSAP在结果推理上具有一定的局限性，但该技术非常具有潜力。

瓜实蝇是中国南方瓜菜生产上的重要害虫，已广泛分布于中国多个省份，每年造成巨大的经济损失和生态环境影响。虽然已对瓜实蝇的生态学、生物学以及生理生化等特性进行了报道，然而瓜实蝇的危害、环境适应及基因表达调控等分子机理的研究鲜有报道。MSAP能够有效地检测到物种种群内或种群间的DNA甲基化差异与表观遗传变异，从而为解析瓜实蝇如何适应外界环境因子的影响提供新的途径。而MSAP又能产生差异性的DNA片段，通过测序可能获得响应基因的重要信息，从而使得基因与表型联系在一起，为深入探讨瓜实蝇基因表达调控与表型提供了重要的研究方向。由此可见，DNA甲基化在生物个体应对环境变化中发挥着重要作用。建立瓜实蝇DNA甲基化的分析技术具有重要意义。本研究建立并优化瓜实蝇MSAP分析技术，为不同条件下瓜实蝇基因组DNA甲基化多态性位点的研究奠定基础。

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