同时测定6种柿叶黄酮类物质方法的建立

安淼 余贤美 王洁 刘加芬 艾呈祥

摘 要：为建立一种同时测定6种柿叶黄酮类物质的方法，通过对液相色谱检测波长、流动相、柱温等条件的探索，最终确定了芦丁、山柰素、异鼠李素、槲皮素、异槲皮苷和紫云英苷6种黄酮类物质标准品的液相色谱检测条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.5%乙酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，0～100 min A∶B为20∶80，105 min后为40∶60；检测波长为360 nm；柱温为35℃；体积流量1.0 mL/min。并以两个品种的柿叶为样品，对所建立的方法进行验证，得到了预期结果，说明建立的检测方法是可行的。

关键词：柿叶；黄酮类物质；高效液相色谱；同时检测

中图分类号：S665.209.9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）05-0131-06

Abstract The HPLC method for simultaneous detection of 6 flavonoids from persimmon leaves was established by exploring the detection conditions such as wavelength， mobile phase and column temperature. The 6 flavonoids were lutin， kaempferol， isorhamnetin， quercetin， isoquercitrin and astragalin. The results showed that the 6 flavonoid standards could be detected simultaneously under the following conditions： using C18 as stuffing bulking agent， carbinol as mobile phase A and 0.5% acetic acid as mobile phase B； the samples were gradiently eluted at the ratios of phase A∶B as 20∶80 in 0～100 minutes and 40∶60 after 105 minutes； and the detection was carried out with 360 nm of wavelength， 35℃ of column temperature and 1.0 mL/min of volume flow rate. The detection method was verified with the leaves of two persimmon varieties， and the expected results were obtained， which indicated that the established method was feasible.

Key words Persimmon leaves； Flavonoid； HPLC； Simultaneous detection

柿叶中含有丰富的黄酮苷、芦丁、三萜类、酚类、胆碱、维生素C、胡萝卜素、香豆素、植物甾醇类、有机酸、脂肪酸、挥发油、生物碱、还原糖、多糖、鞣质、香脂精、多种氨基酸及铁、锌、钙等对人体健康有益的营养成分[1]。近几年，随着人们越来越注重健康的生活，柿叶的功能成分逐渐受到重视。

黄酮类物质是柿叶中最主要的功能成分，已发现的柿叶黄酮类物质主要有紫云英苷、黄芪苷、槲皮素、异槲皮苷、山柰酚、芦丁、芸香苷、金丝桃苷、杨梅树皮苷等[2]。对柿叶黄酮的开发研究，可提高柿树的利用效率，增加其经济效益。

目前，对于柿叶黄酮的研究主要是总黄酮或少量几种黄酮类物质的提取[3～5]、检测方法及含量分析[6，7]，以及不同品种间总黄酮含量的比较[8]。关于同时检测柿叶中6种黄酮类物质的方法迄今未见报道。笔者以西村早生和禅寺丸两个品种的柿叶为材料，通过对液相色谱条件的摸索，建立了一种同时检测6种柿叶黄酮类物质的液相色谱检测方法，为适宜柿叶茶等深加工的高黄酮柿树品种的选育做前期探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 索氏提取器；Agilent LC1260 高效液相色谱仪；DAD紫外二极管阵列检测器；ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6 mm×250 mm，5 μm色谱柱。

1.1.2 试剂 芦丁标准品、山柰素标准品、异鼠李素标准品、槲皮素标准品、异槲皮苷标准品、紫云英苷标准品，购自Sigma；色谱级甲醇，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；色谱级冰乙酸，购自天津市凯通化学试剂有限公司；水为超纯水。

1.1.3 柿叶样品 西村早生和禅寺丸两个品种的柿叶样品取自山东省果树研究所万吉山柿树试验示范基地。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色谱检测条件的选择 检测波长的确定：对6种标准品分别进行紫外全波长扫描，根据吸收光谱图中的吸收峰确定检测波长。

流动相的选择：以乙腈-0.5%乙酸、甲醇-0.5%乙酸为流动相，根据分离效果选择适宜流动相。

流动相比例的选择：比较甲醇-0.5%乙酸比例分别为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40的流动相，根据分离效果确定最佳流动相比例。

柱温的选择：比较25、30、35、40℃几种柱温条件下的分离效果，确定最适柱温。

体积流量的选择：比较0.4、0.8、1.0 mL/min不同体积流量，根据峰型及分离效果确定最佳体积流量。

1.2.2 校正表的建立 精密称量芦丁标准品5.1 mg，异槲皮苷标准品5.1 mg，紫云英苷标准品5.2 mg，槲皮素标准品5.1 mg，山柰素标准品4.9 mg，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容并摇匀。精密称量异鼠李素标准品5.2 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容并摇匀。取芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰素标准品母液各4 mL，取异鼠李素标准品母液20 mL，混合置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得混合标准品贮备液。分别取混合标准品贮备液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得不同浓度混合标准品溶液。精密吸取不同浓度混合标准品溶液各20 μL，注入液相色谱仪进行检测，计算校正表。

1.2.3 液相色谱检测方法的验证 样品溶液的制备：将新鲜叶片洗净，105℃杀青15 min后于70℃烘干。干燥叶片经0.5 mm孔筛粉碎，得样品粉末。称取样品粉末约1 g，置于索氏提取器中，使用四氯甲烷回流除杂后用甲醇回流提取至无色。将提取液转移至100 mL容量瓶中，用少量甲醇洗涤容器，洗液并入同一容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。使用0.22 μm微孔有机滤膜过滤，得供试样品溶液。

样品中6种黄酮类物质含量的测定：精密吸取供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，按照建立的液相色谱条件对样品进行检测。根据色谱图，经校正表计算，得到样品中各黄酮类物质的含量。

2 结果与分析

2.1 液相检测条件的建立

2.1.1 检测波长的确定 对6种黄酮类物质标准品进行紫外全波长扫描，结果显示，各标准品在257 nm和360 nm处均有较高的吸收峰（图1）。但是257 nm处受到溶剂吸收峰等干扰，故选择360 nm作为检测波长。

2.1.2 流动相的确定 对乙腈-0.5%乙酸、甲醇-0.5%乙酸两种流动相体系的分离效果进行比较，结果显示，使用乙腈-0.5%乙酸做流动相，分离度差，且进样时溶剂峰较明显；使用甲醇-0.5%乙酸做流动相，分离效果较好，且样品的溶解和提取均使用甲醇，因此，选用甲醇-0.5%乙酸为流动相以减少溶剂峰的影响。

2.1.3 流动相比例的确定 当甲醇浓度为30∶70或以上时，混合标准品中异槲皮苷与芦丁难以分开。当甲醇浓度为20∶80或以下时，难以出峰。故选择梯度洗脱，使用低甲醇比例流动相使样品分离，再用较高甲醇比例流动相使样品出峰。

以甲醇-0.5%乙酸为流动相，比较了几种比例流动相的梯度效果，结果显示，先使用20∶80流动相，后改为40∶60可以达到分离样品与出峰峰型较好的平衡。

2.1.4 柱温的确定 比较了25、30、35、40℃几种柱温条件下的分离效果，高柱温时保留时间短，低柱温条件下保留时间延长，但由于峰型变宽，分离度反而降低。综合考虑，选择35℃作为柱温条件。

2.1.5 体积流量的确定 经比较，体积流量为1.0 mL/min时，峰型及分离效果均较好，因此，确定1.0 mL/min为高效液相色谱检测的最佳体积流量。

2.1.6 液相检测条件的确定 综合上述结果，确定高效液相色谱检测条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.5%乙酸溶液为流动相B，按表1的条件进行梯度洗脱；检测波长为360 nm；柱温为35℃；体积流量为1.0 mL/min；进样量为20 μL。

2.1.7 混合标准品色谱图 以上述建立的条件对6种黄酮类物质混合标准品进行检测，得到混合标准品色谱图（图2），6种标准品得到了很好的分离，保留时间由短至长分别为异槲皮苷、芦丁、紫云英苷、槲皮素、山柰素、异鼠李素。

2.2 校正表的建立

将6种黄酮类物质标准品混合，取不同浓度混合标准品溶液（表2）注入液相色谱仪，在360 nm处检测其吸光度，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标做标准曲线，得到6种黄酮类物质的回归方程（图3）。

2.3 样品中6种黄酮类物质含量测定

用上述建立的方法，测定了西村早生及禅寺丸两个品种柿叶的6种黄酮类物质，根据色谱图（图4），按照标准曲线进行计算，得出西村早生中各黄酮类物质含量（mg/g干燥叶）：异槲皮苷2.31；芦丁0.13；紫云英苷6.8；槲皮素0.51；山柰素0.52。禅寺丸中各黄酮类物质含量（mg/g干燥叶）：异槲皮苷1.35；芦丁2.04；紫云英苷4.39；槲皮素1.64；山柰素2.04；异鼠李素0.075。

3 结论与讨论

黄酮类物质是一类重要的生理活性物质，具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗衰老、抗癌等功能[9～14]。在中药中测定黄酮含量已趋于成熟，《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）（一部）中详细记载了天南星、沙棘、槐花等几种中草药总黄酮含量及单种黄酮类物质含量的测定方法，以及山楂叶总黄酮含量的测定和银杏叶总黄酮醇苷含量的测定方法[15]，其他果树黄酮含量的测定并没有记载。用于柿叶黄酮类物质的检测方法主要有分光光度法[16，17]、高效液相色谱法[6，7，18，19]和薄层色谱法[20，21]。本试验采用高效液相色谱法，借鉴《中国药典》中关于其他中草药黄酮类物质的测定方法，建立了一种同时测定6种黄酮类物质的方法。

试验过程中发现，在制备标准品母液时，由于异鼠李素在甲醇中的溶解度较低，无法达到其他标准品母液的浓度，因此，使用较大量甲醇将其溶解，得到较低浓度的母液，在配制混合标准品贮备液时，按比例吸取各标准品母液，使各标准品浓度相近，便于计算。

试验中还发现，山柰素（3，5，7-三羟基-4-甲氧基黄酮）和山柰酚（3，5，7，4-四羟基黄酮）标准品在所建立的HPLC条件下，吸收峰重叠无法分开，有可能与二者结构极其相似有关。因此，本试验以山柰素为标准品分析其含量。

选择检测波长时，紫外全波长扫描结果显示，各标准品在257 nm和360 nm处均有较高的吸收峰。但在试验中发现257 nm处受到溶剂峰干扰，而在360 nm处各标准品可得到较好的图谱，所用溶剂截止波长均在257 nm以下[22]，因此，选择360 nm为检测波长。

选择流动相时，比较了乙腈-0.5%乙酸、甲醇-0.5%乙酸两种流动相体系的分离效果，发现使用乙腈-0.5%乙酸做流动相，分离度差，且溶剂峰较明显。另外，标准品溶液的制备和样品的提取均使用了甲醇，因此，选用甲醇-0.5%乙酸为流动相以减少溶剂峰的影响。对于流动相比例，选择梯度洗脱，先使用20∶80，后改为40∶60可以取得较好的效果。在上述条件下，体积流量超过1.0 mL/min时，压力过大，为防止对设备的损害，不考虑更大体积流量。

本试验建立的梯度洗脱方法，可以达到分离样品与出峰峰型较好的平衡，但总体时间较长。对于如何在保证样品分离度与出峰峰型的前提下，进一步缩短总体保留时间，提高试验效率，有待于进一步研究。

为验证所建立方法的可行性，笔者以西村早生和禅寺丸两个品种的柿叶为样品，测定了6种黄酮类物质的含量。2个品种柿叶中均检测到芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰素，而异鼠李素仅在禅寺丸中有微量发现（0.075 mg/g干燥叶）。是否完全没有或者含量低于可测定限值，以及哪些品种柿叶中可能含有异鼠李素，有待于进一步研究。

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