四逆汤中甘草减附子之毒的代谢组学研究

李莹 傅超美 彭伟 李波 傅舒 张慧敏

[摘要]基于GCMS代谢组学方法分析四逆汤和缺甘草四逆汤干预后大鼠血浆中的内源性代谢物变化，研究四逆汤中甘草对附子的减毒作用。18只SD大鼠，随机平均分为正常组、四逆汤组和缺甘草四逆汤组。四逆汤组和缺甘草四逆汤组分别灌胃药液（生药质量浓度为08 g·mL-1），剂量为002 mL·g-1，每日1次，连续7 d；正常组给予等体积的生理盐水。末次给药05 h，收集血浆样本，应用GCMS检测。数据进行多元统计分析，得到14个潜在代谢标志物（指认13个），并对其相对含量及代谢途径进行分析。与缺甘草方组相比，四逆汤组对7个代谢标志物进行了回调。通过对这些代谢标志物的生理功能分析，推测四逆汤中甘草可以通过调节方中附子对糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环和部分氨基酸等生物代谢途径的影响减低附子之毒性。

[关键词]四逆汤；代谢组学；大鼠血浆；甘草；附子；减毒

[Abstract]To analyze the endogenous metabolite changes in rat plasma after intervention by Sini Tang and Sini Tang without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma based on GCMS metabonomics technology， and study the toxicity reduction effect of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in Sini Tang on Aconiti Lateralis Radix Preparata Eighteen SD rats were randomly divided into normal group， Sini Tang group and Sini Tang without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma group on average The rats in Sini Tang group and Sini Tang without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma group were treated respectively with physic liquor by intragastric administration at the dose of 002 mL·g-1 （equivalent to 08 g·mL-1 crude drugs） once a day for 7 days The rats in normal group were given with equal volume of saline solution The plasma samples were collected from each rat 05 h after the last administration for GCMS detection The data was used for multivariate statistical analysis to obtain 14 potential metabolic markers（13 of them were identified） Then their relative content and metabolic pathways were analyzed Compared with Sini Tang without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma group， seven metabolic markers of were reduced in Sini Tang group Analysis on physiological functions of these potential metabolic markers showed that the Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in Sini Tang could reduce the toxicity of Aconiti Lateralis Radix Preparata by adjusting the glycolysis， lipid metabolism， citrate cycle and some amino acids metabolism

[Key words]Sini Tang； metabonomics； rat plasma； Glycyrrhizae Radix et Rhizoma； Aconiti Lateralis Radix Preparatal； toxicity reduction

doi：10.4268/cjcmm20160826

四逆汤为张仲景所创急救之名方，始载于《伤寒杂病论》，由附子、甘草（炙）、干姜组成[1]，为1977年至现行各版《中国药典》所收载[2]。临床用于“少阴病，脉沉者”，症见“吐利汗出，发热恶寒，四肢拘急，手足厥冷”，主要用于治疗冠心病、心绞痛、心力衰竭、多种原因所致的休克等心血管疾病，具有保护心肌、保护血管、抗休克、降血压等药理活性[35]。四逆汤中君药附子为大辛大热之品，回阳温里，破阴逐寒；附子毒性峻烈，方中佐使甘草以解毒。如《景岳全书》所载：“附子之性急，得甘草而后缓；附子之性毒，得甘草而后解。”四逆汤各味药煎煮后的药物组分或代谢物进入血液循环，产生潜在而复杂的毒性与保护作用，最终输送到心脏等靶点产生作用[6]。通过内源性代谢物表达水平的改变，分析研究机体对进入血液的药物成分及机体应答所表征的“毒”与“解毒”[710]。

课题组前期已对体外模拟药物组分随血液循环作用于MIRI模型的H9c2心肌细胞而产生的内源性代谢物水平进行研究[11]。本研究采用GCMS分析四逆汤和缺甘草四逆汤干预后的大鼠血浆成分，运用代谢组学方法分析其大鼠血浆中的内源性代谢物变化，研究四逆汤中甘草对附子的减毒作用，从体内角度进一步阐释四逆汤中甘草减附子之毒的作用机制。

1材料

7890A GC/5975 MSD气相色谱质谱联用仪（Agilent，美国）；METTLER AE240电子分析天平（Mettler Toledo，德国）；BF 2000/15A氮气吹干仪（BFC 北京八方世纪科技有限公司）；WH3微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；Heraeus Megafuge 10R通用离心机（Thermo，美国）。

甲醇、乙腈（Fisher Chemicals，美国）；甲氧胺盐酸盐，TMCS，MSTFA，吡啶，正庚烷（SigmaAldrich，美国）；乳酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、尿素、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖、肌醇、胆固醇等对照品均购自上海安研商贸有限公司；内标物白术内酯Ⅱ为实验室自制（纯度≥9985%）；实验用水均为超纯水（MilliQ级），其余试剂均为分析纯。

附子（批号130205）购自四川江油中坝附子科技发展有限公司，炙甘草（批号130204）、干姜（批号130102）均购自四川科伦天然药业有限公司，经西南民族大学刘圆教授鉴定，分别为毛茛科植物乌头Aconitum caimichaeli Dobx子根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根及根茎的炮制品，姜科植物姜Zingiber officinale （Willd） Rosc 的干燥根茎，且均符合2015年版《中国药典》规定。

清洁级SD健康大鼠，体重（200±20） g，雌雄各半，购自四川达硕实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（川）201324，饲养标准饲料和饮用水，试验前12 h禁食不禁水。

2方法与结果

21四逆汤和缺甘草四逆汤样品的制备

四逆汤和缺甘草四逆汤样品的制备方法已在本课题组的前期研究中进行描述[1112]，各自制备得到生药质量浓度08 g·mL-1的药液。

22动物试验

18只SD大鼠，随机分别为3 组（正常组、四逆汤组、缺甘草四逆汤组），每组6只。

四逆汤组：灌胃预先温热的四逆汤药液，剂量为002 mL·g-1，每日1次，连续7 d；缺甘草四逆汤：灌胃预先温热的缺甘草四逆汤药液，其他同四逆汤组；正常组：灌胃等体积的生理盐水。末次给药05 h，眼眶后静脉丛采血，于预先肝素化的EP管中，以4 500 r·min-1离心10 min，分离血浆，于-70 ℃冷冻保存，备用。

23GCMS血浆样品前处理

取血浆样品于室温解冻，精密吸取100 μL，接下来的制备方法已在本课题组的前期研究中进行描述[1112]，最后制得300 μL样品溶液至GC进样瓶，待测。

24GCMS分析系统

TR5MS毛细管柱（Agilent，美国，30 m×250 μm×025 μm）；高纯氦气为载气，流速1 mL·min-1；进样量10 μL，不分流进样；进样口温度260 ℃；离子源（EI）温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电离电压70 eV；He扫气流量10 mL·min-1；扫描范围m/z 30～600。升温程序为：初始温度70 ℃，保持4 min，以6 ℃·min-1升至115 ℃，以4 ℃·min-1升至126 ℃，以6 ℃·min-1升至190 ℃，以1 ℃·min-1升至194 ℃保持2 min，以3 ℃·min-1升至280 ℃。

25GCMS方法学验证

251精密度试验分别取等体积的正常组、四逆汤组和缺甘草方组的血浆样品混合，作为质控样品（QC），考察所建立GCMS方法的稳定性[1314]。按23项下方法处理质控样品。将质控样品随机放于进样序列中，分析9次。将输出的GCMS图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004年A版软件进行评价，相似度大于0998，60个主要共有峰保留时间的RSD为0010%～015%（内标物保留时间的RSD为0010%），峰强度RSD为0030%～13%（内标物峰面积的RSD为36%），表明仪器精密度良好。

252稳定性试验取四逆汤组血浆样本，经2个冻融循环过程后，按23项下方法平行制备3份GCMS供试品。并将其中一份样本放于进样系统中，分别于0，8，16，24，36 h进行GCMS分析，将采集的GCMS图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004年A版软件进行评价，相似度大于0995，60个主要共有峰峰强度的RSD为037%～15%，表明血浆样本经2个冻融循环过程后基本保持稳定，GCMS供试品在36 h内基本稳定。

26血浆组分GCMS代谢指纹分析

将采集的每组6个样本的GCMS原始数据经格式转换和标准化后，输入到《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004年A版软件，对GCMS数据进行处理分析。分别采用中位数法生成与3组对应的3个对照谱图（R1正常组，R2四逆汤组，R3缺甘草方组）并导出，将3个对照谱再次进行相似度评价（图1，2）。

3个对照谱相似度计算结果为（R1R2 0988）>（R2R3 0964）>（R1R3 0938）。由相似度结果可知，四逆汤组与正常组的代谢物成分组最为接近，四逆汤组与缺甘草方组的代谢物成分组次之，正常组与缺甘草方组的代谢物成分组相差最大。

27数据分析

大鼠血浆GCMS总离子流（图3）原始数据经预处理后，得到由质荷比、保留时间和强度构成的三维数据矩阵。根据所测的主要离子碎片信息，与AMDIS和NIST08质谱数据库信息核对。经MATLAB（R2009a，The Math Works， Inc）软件处理后，得到包括样本名、保留时间、质荷比、归一化后峰强度的数据矩阵。应用SIMCAP 130（Umetrics，瑞典）软件对数据进行主成分分析（PCA）（图4）、正交最小二乘分析（OPLSDA）（图5）及最小二乘分析（PLSDA）分析（图6）。OPLSDA，PLSDA模型分析中，采用CVANOVA检查组间差异，结果均满足P<0001，所建模型的组间差别均具统计学意义。

A，B，C区为TIC图中局部放大。

图3四逆汤组大鼠血浆GCMS总离子流图

Fig3Typical total ion chromatogram of rats plasma Sini Tang group by GCMS

结合Splot与变量权重重要性排序VIP>1，筛选出14个代谢标志物（图3）。14个代谢标志物的相对含量采用Minitab V150（State College，美国）软件进行oneway ANOVA （置信区间95%）检验（表1）。

从图5，6及表1可知，14个潜在代谢标志物中，与正常组比较，缺甘草方组中相对含量明显升高的包括乳酸、L丙氨酸、β羟基丁酸、3磷酸甘油、谷氨酰胺、肌醇、未知物；缺甘草方组中相对含量明显降低的包括缬氨酸、尿素、L亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、葡萄糖、胆固醇。与缺甘草方组比较，四逆汤组明显进行回调的化合物包括乳酸、L丙氨酸、β羟基丁酸、3磷酸甘油、谷氨酰胺、葡萄糖、肌醇。

3讨论

四逆汤中“附子之性毒，得甘草而后解”是机体处置四逆汤中复杂成分组之后的整体表征。采用GCMS对四逆汤组与缺甘草方组的大鼠血浆进行

物代谢途径的影响得以实现的。

14个代谢标志物中乳酸盐、葡萄糖和3磷酸甘油与糖酵解相关，表明四逆汤中甘草解附子之毒与糖酵解的途径有关。与正常组比较，缺甘草方组中，乳酸和3磷酸甘油的含量水平升高，葡萄糖的含量水平降低[1516]。其中，乳酸盐的水平下调，分析可能与机体中的相关乳酸脱氢酶调控有关。四逆汤组中因甘草与附子的药物成分反应后再作用于机体，调控了相关乳酸脱氢酶的活性，使乳酸的含量显著回调。缺甘草方组的葡萄糖含量升高可能是由于缺甘草四逆汤中附子与干姜“相须/相使”增强回阳之功但燥热之性更甚，使机体对葡萄糖利用率下降[17]所致。缺甘草方组中3磷酸甘油含量升高，可能是附子毒性成分进入机体后抑制了糖酵解中第一个能量利用酶——甘油醛3磷酸盐脱氢酶（GAPDH）活性有关[18]。

与正常组比较，缺甘草方组中胆固醇的含量上调，四逆汤组将胆固醇含量进行了回调，与四逆汤能降低血浆总胆固醇（TC）的作用[19]及甘草能降低胆固醇含量研究结果相一致[20]。同时，因四逆汤组的葡萄糖和缬氨酸等氨基酸含量均降低，其共同的代谢产物乙酰CoA也减少，以乙酰CoA为合成原料的胆固醇含量也相应降低[18]。

与正常组相比，缺甘草方组中α氨基酸（缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸）的含量均降低。附子中的毒性成分诱导心肌细胞消耗心肌能量，致ATP耗竭，而作为能量代谢的重要前体α氨基酸及其转化为其他生物分子，α氨基酸的含量变化可能与缺甘草方中干姜与附子协同发挥辛热而助阳之功有关，或此应激致使α氨基酸的代谢重构以满足心肌细胞对能量的需求造成的[21]。同时，与缺甘草方组比较，四逆汤组仅对缬氨酸含量水平进行一定回调，相反对尿素的含量没有进行回调反而下调。附子毒性的代谢组学研究结果[1516]显示，β羟基丁酸与谷氨酰胺的含量水平降低，而本研究中缺甘草方组与正常组比较，二者的含量水平升高，相反四逆汤组中β羟基丁酸与谷氨酰胺的含量水平降低。据此分析，缬氨酸、尿素、β羟基丁酸和谷氨酰胺可能与缺甘草方组中的干姜对附子的毒性及增加附子药效相关。

与正常组相比，缺甘草方组肌醇的含量升高，四逆汤组将肌醇的含量进行回调。肌醇可能与双酯型乌头碱对心脏的中毒机制有关，使Na+K+ATPase的活性[22]异常，心肌细胞Na+ 通道开放，Na+ 加速内流，产生心脏毒性[2324]，同时肌醇的含量升高；还可能为附子毒性成分干扰磷脂的生物合成，使肌醇的含量积蓄[18]；肌醇可能同时参与转化1，6双磷酸果糖（F1，6BP）而参与到糖酵解途径[25]。一个未知成分在四逆汤组与缺甘草方组中的含量差异非常显著，但其保留时间太靠后，与溶剂、保护气等杂质峰混在一起，难以进行定性识别。

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[责任编辑曹阳阳]