丹参雄性不育与可育近等基因系差异片段的发掘

梁文洁 卢聪宇 舒志明 周仔莉 叶嘉钰 张跃进 梁宗锁

[摘要]利用雄性不育系培育新品种和生产杂种一代，在产量、品质等方面均具有独特优势。前期课题组已通过多代连续杂交获得丹参雄性不育与可育近等基因系。该文在前期工作基础上采用AFLP和BSA技术对378对引物进行筛选，发现7对引物和26个标记与丹参育性调控基因紧密连锁，由此构建出连锁遗传图谱。以前期发现的E11/M4208标记为模板，运用染色体步移技术，在不育和可育系中分别扩增出2 028，2 027 bp的差异片段，发现4个突变碱基位点均处于内含子中。在所有差异标记中发现E01/M09418，E05/M13308，E05/M04750，E01/M01204 4个与丹参育性调控基因紧密连锁的标记，与拟南芥1，3，5号染色体相似性达100%。其中与育性调控基因距离很近（21 cM）的E01/M09418与同处于拟南芥第3号染色体的核不育基因MS2相似度高达100%。不育系中获得的2 028 bp片段与MS2基因在两处相似度达100%。 与拟南芥第5号染色体相似度100%的E05/M04750，与杨树POP085M05基因和拟南芥中低亲和力钙逆向转运蛋白序列具有较高相似性，且E非常低。该文遗传图谱的构建和功能性差异序列的发现，为后续准确锚定丹参基因组中育性调控基因及揭示其功能奠定了坚实基础。

[关键词]丹参；雄性不育；近等基因系；可育系；染色体步移；差异序列；遗传图谱；AFLP

[Abstract]There is distinctive advantage of using male sterile lines to breed new cultivar and produce hybrids， when compared with general breeding method on yield and quality In our previous work， nearisogenic lines （NILs） of male sterile and fertile Salvia miltiorrhiza have been obtained through continuous hybridization in many years In this investigation， 378 primer combination were screened by using AFLP and BSA technique， in which 26 markers amplified from seven primers were found to tightly link to male sterile gene Based on these markers， two linkage genetic maps were constructed A 2 027，2 028 bp fragment was amplifed from NILs of fertile and sterile S miltiorrhiza， respectively， using genome walking technique and previous E11/M4208 marker as template Four base mutations were found in intron when comparing both fragments Among all different markers between NILs of male sterile and fertile S miltiorrhiza， four was found to have 100% identities to chromosome 1， 3 and 5 of Arabidopsis， namely， E01/M09418， E05/M13308， E05/M04750 and E01/M01204 The E01/M09418 marker was very close to male sterile gene of S miltiorrhiza with distance of 21 cM， which also had 100% identities to male sterile gene MS2 in Arabidopsis Both were distributed in chromosome 3 of Arabidopsis The 2 028 bp fragment also had 100% identities to MS2 gene Another E05/M04750 marker that had 100% identities to chromosome 5 of Arabidopsis was found to have high identities to POP085M05 gene of poplars and low affinity calcium antiporter CAX2 of Arabidopsis with very low Evalue The constructed genetic map and differential fragments with potential functions found in this study provide a solid foundation to lock male sterile genes in S miltiorrhiza genome and to discover their functions

[Key words]Salvia miltiorrhiza； male sterility； nearisogenic lines； fertile lines； genome walking； different fragments； genetic map； AFLP

doi：10.4268/cjcmm20160808

丹参Salvia miltiorrhiza Bunge根茎是我国常用大宗药材之一，在治疗心脑血管疾病、抗氧化方面具有显著疗效，药理成分基本清楚[1]。丹参植物具有基因组小、染色体数目少、组织培养和转基因技术成熟等特点，被认为是中药研究的理想模式植物[2]。

研究已发现，利用雄性不育系培育作物新品种和生产杂种一代，在产量、品质、整齐度和抗逆性等方面均具有独特优势，如超级杂交稻、杂交油菜和杂交小麦等。但药用植物中基因型一致的品种少，种子来源混杂，个体间有效成分含量差异大，栽培数年后种质易退化，影响药材质量稳定[3]。栽培药材质量首先取决于其优良的遗传品质，这主要通过品种选育获得[4]。

前期课题组发现丹参雄性不育突变株后[5]，利用不同亲本组合杂交发现丹参杂种优势非常明显，不育系干根产量高出可育系30%以上，有效成分含量明显提高，丹酚酸B质量分数达4%～10%（平均6%）。通过对其遗传规律、制种技术的研究，获得了丹参雄性不育与可育近等基因系[6]。利用128对AFLP（扩增片段长度多态性）引物和BSA（群体分离分析法），获得1对引物（E11/M4208）与丹参育性调控基因紧密连锁[6]。为发掘更多与丹参育性调控基因紧密连锁的标记，本文设计并合成了378对AFLP引物继续进行筛选；同时对前期获得的E11/M4208片段，采用染色体步移（genome walking）技术在其上下游进行延伸扩增，以期找出丹参雄性不育与可育近等基因系中的差异位点。将这些差异片段在测序后与拟南芥等物种进行了比对分析，从而为后续在丹参基因组中准确锚定育性调控基因、探索其功能奠定基础。

1材料

2013年6月从西北农林科技大学药用植物园中随机选取第5组合丹参雄性不育和可育近等基因系不育株16株（标记为S1～S16），可育株8株（标记为F1～F8）进行挂牌标记，作为本文试验材料。

2方法

21DNA提取与AFLP标记技术采取丹参雄性不育与可育近等基因系植株的幼叶，用锡箔包好标记后立即投入液氮中带回实验室，后在-80 ℃冰箱中保存备用。丹参基因组DNA提取、AFLP标记技术、差异片段回收与测序等流程均参照前期工作进行[6]。

22AFLP引物设计在实验室前期设计AFLP引物的基础上[67]，再次设计21条EcoR I （E00+3）引物（标记为E1E21）和18条Mse I（M00+3）引物（标记为M01M18）（表1），共计378（21×18）对引物组合。

23利用丹参群体验证AFLP差异片段与育性调控基因是否连锁将在基因池中出现差异条带的引物再在群体所有个体中进行群体验证。用“0，1”记录聚丙烯酰胺凝胶电泳图上的条带，有条带标记为“1”，没有条带标记为“0”，分别统计差异条带在可育和不育群体中出现的比率。并根据验证结果来计算遗传距离（cM）。

其中，重组率（r）= 重组型植株数/群体单株总数×100%；而重组率（r）与2个位点在染色体上的遗传距离（M）具有如下函数关系。

Kosambi公式：M=ln（1+2r）/（1-2r）·1/4；r=[1-e-4M]/ [1+e-4M]1/2。

24连锁遗传图谱构建将分子标记和育性性状数据输入并运行Mapmaker 30 软件构建遗传连锁

图谱。Mapmaker 30是专门用于构建分离标记的遗传连锁图谱软件，可对共显性和显隐性标记作多点连锁分析（multipoint linkage analysis），既可同时估计整体数据间的连锁关系，又可自动排除数据内误差对结果的影响。

25染色体步移技术及引物设计利用Primer 50软件设计引物，以实验室前期得到的E11/M4208片段为模板，设计出3条上游特异性引物和3条下游特异性引物（表2）。染色体步移技术按照TaKaRa试剂盒说明书进行，共进行3轮巢式PCR。将染色体步移技术扩增得到的片段用快速凝胶试剂盒Biotake进行回收，并与PMD19T载体在16 ℃条件下连接过夜。在过夜培养的平板上挑取单菌落于含有AMPr（100 mg·L-1）的LB液体培养基中摇菌10～12 h。用PMD19T通用引物M13F与M13R进行菌落PCR检测。用质粒小提试剂盒（康为）从培养过夜的菌液中提取重组质粒，进行PCR鉴定，测序验证。将上下游序列测序结果用DNAMAN软件进行拼接，得到序列全长。用Primer 50软件根据拼接得到的序列在拼接片段的上下游设计引物，分别在丹参雄性可育和不育基因池中进行全长序列扩增。

将PCR扩增获得的片段进行胶回收，并与PMD19T载体在16 ℃连接过夜，转化验证后送上海生工测序。将丹参雄性不育和可育基因池扩增片段的测序结果用DNAMAN软件进行比对，寻找两者差异位点。

26差异片段的比对分析将筛选出的差异片段测序后，将序列提交至NCBI数据库，运行BLAST程序进行差异片段同源性分析，统计相似度高的同源序列。

3结果与分析

31AFLP引物扩增与筛选以构建的丹参雄性不育和可育池为材料，对378对AFLP引物进行了2次重复扩增筛选。其中10对引物在可育与不育基因池PCR扩增中稳定地表现出差异片段。经群体验证后发现7对引物（E01/M1，E01/M9，E03/M3，E03/M10，E05/M10，E05/M13，E05/M04）与育性调控基因紧密连锁。这7个引物扩增出差异条带141条，每个引物平均条带201条（表3，图1）。其中E01/M01和E01/M09这2对引物扩增出的标记与育性调控基因遗传距离最小（21 cM）（图2）。

32连锁遗传图谱构建经软件分析，141条差异片段中有26条与丹参育性调控基因紧密连锁，占总差异片段的184%。这26条差异标记在测序后被构建在2个连锁群中（图2），总遗传距离为3256 cM。标记间最大距离为402 cM，位于连锁群EM2

33丹参雄性不育与可育系染色体步移片段的获得以E11/M04208片段为模板，运用染色体步移技术分别扩增获得上游1 000 bp，下游1 800 bp的片段，并通过菌落PCR和质粒PCR验证。测序后将上下游扩增序列进行拼接，设计特异性引物在可育基因池与不育基因池中再次进行全序列扩增。除去PMD19T通用引物序列后在可育系中得到2 027 bp的序列，不育系中得到2 028 bp的序列（图4）。经DNAMAN序列比对，发现分别不育系在第662（C→T），690（C→T），1 072（G→A），1 800（T→C）位碱基发生突变，且均发生在内含子区域。

34差异片段的比对分析运用BLAST程序对所有AFLP差异片段和不育系中染色体步移获得的2 028 bp片段进行比对分析，发现只有E01/M09418，E05/M13308，E05/M04750和E01/M01204标记与拟南芥1，3，5号染色体相似性均为100%，E在046～88（表5）。

将所有AFLP差异片段与拟南芥中已发现的一个仅有的核不育基因MS2（位于拟南芥第3号染色体，GenBank登录号NM1120322）[8]序列进行比对，发现E01/M09418、E05/M04750标记和在不育系中通过染色体步移技术获得的2 028 bp片段与MS2基因均具有100%相似度。

将所有AFLP差异片段与杨树等物种基因组（片段）序列比对，发现E01/M09418，E05/M13308，E01/M01204，E01/M01230与潘那利番茄等物种的相似度达到100%。虽然E05/M04750与杨树POP085M05基因序列的相似度仅有85%，但E非常小，仅有6E33（表6）。这说明杨树中该基因可能与育性有关。

因不育系中获得的2 028 bp序列翻译成氨基酸序列后与拟南芥也没有相似性，所以无法参与做氨基酸序列相似性分析。将能够比对到拟南芥染色体上的E01/M09418，E05/M13308，E05/M04750，E01/M01204标记（表5）翻译成氨基酸序列，与拟南芥蛋白质数据库进行比对，发现E05/M04750与拟南芥低亲和力转运蛋白CAX2相似度最高（75%），E也非常小，仅有8E-25（表7）。

4讨论

在前期发现1对引物与丹参育性调控基因紧密连锁的基础上[6]，本文再次发掘到7对紧密连锁引物。在扩增出的141个差异片段中有26个与育性调控基因紧密连锁。据此本文首次在丹参中对这些与育性调控基因紧密连锁的标记进行了遗传图谱构建（图3）。EM1图谱中10个标记和EM2图谱中5个标记与育性调控基因的距离均小于10 cM，在丹参全基因组序列公布后将能较精确锚定到丹参染色体及其序列上。从而为准确找寻丹参育性调控基因奠定了坚实基础。

本文发现E01/M09418，E05/M13308，E05/M04750和E01/M01204标记不仅与丹参育性调控基因紧密连锁，而且与拟南芥1，3，5号染色体相似性达100%（表5）。与育性调控基因距离很近（21 cM）的E01/M09418，E01/M01204均分布在拟南芥3号染色体上。其中E01/M09418与同处于3号染色体的核不育基因MS2[8]的相似度达100%，在不育系中通过染色体步移技术获得的2 028 bp片段与MS2基因的相似度也达100%，可能预示丹参中这2个片段与育性调控密切相关。

与拟南芥5号染色体相似度很高的E05/M04750，除与MS2基因有较高相似度外，与杨树的POP085M05基因和拟南芥的低亲和力转运蛋白也均有较高相似度，且E非常低，推测该片段可能在丹参育性转变过程中发挥了重要作用，同时也说明育性转换的调控存在调控链，在不同染色体的基因或蛋白中可能存在互作现象，或在同一调控链中存在上下游关系。

将拟南芥雄性核不育基因MS2与在不育系中通过染色体步移技术获得的2 028 bp片段进行比对，发现MS2基因在2 028 bp片段的第1 500，2 000 bp左右的相似性极高。不育与可育系（2 027 bp）的4个突变位点中后两个突变分别在第1 072，1 800个碱基，突变位点均在内含子中。研究已发现内含子突变，对其后外显子的剪切、翻译均具有显著影响[9]。奇特的是，可能与丹参育性调控密切相关的E01/M09418，E05/M04750片段与不育系2 028 bp片段没有相似度。由此也进一步证明，丹参育性转换的调控存在调控链或有多个基因和蛋白参与。

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[责任编辑吕冬梅]