HLA—DQB1等位基因与广西壮族人群肝癌家族聚集性的相关性

龚婷婷　吴继周　梁惠萍　卢庭婷　蒋莉　吴健林　胡蝶飞　宁秋悦　庞裕

【摘要】 目的：探讨HLA-DQB1等位基因与广西壮族人群肝癌家族聚集性的相关性，为寻找广西壮族人群肝癌的遗传易感基因或拮抗基因提供线索。方法：采取性别、年龄±5岁配对方法，在广西壮族肝癌高发区选取肝癌高发家族成员、无癌家族成员各48例作为研究对象，采集研究对象外周血并提取全血DNA，应用PCR-SSP方法对HLA-DQB1等位基因进行检测。结果：（1）HLA-DQB1*02/06/07等位基因在肝癌高发家族组和无癌家族组的基因频率分别是8.33%和33.33%、33.33%和8.33%、25.00%和50.00%，差异均有统计学意义（P<0.05）；HLA-DQB1*04/05/08/09分别是0和8.33%、50.00%和41.67%、25.00%和16.67%、8.33%和8.33%，差异均无统计学意义（P>0.05）；（2）HLA-DQB1*02/04/05/06/07/08/09等位基因在乙型肝炎病毒感染组（HBsAg阳性组）及非乙型肝炎病毒感染组（HBsAg阴性组）中的基因频率分别为15.79%和22.08%、0和5.19%、42.11%和46.75%、26.32%和19.48%、47.37%和35.06%、21.05%和20.78%、5.26%和9.09%，差异均无统计学意义（P>0.05）。（3）HLA-DQB1各等位基因与性别无明显相关（P>0.05）。结论：（1）HLA-DQB1*02/07等位基因可能是广西壮族人群肝癌发生的拮抗基因，而HLA-DQB1*06等位基因可能为其易感基因；（2）HLA-DQB1各等位基因可能与广西壮族肝癌高发区乙肝病毒的感染及性别无明显关联。

【关键词】 HLA-DQB1； 等位基因； 原发性肝癌； 家族聚集性

Relationship between HLA-DQB1 Allele and Familial Clustering of Hepatocellular Carcinoma in Guangxi Zhuang People/GONG Ting-ting，WU Ji-zhou，LIANG Hui-ping，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（09）：001-004

【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between HLA-DQB1 allele and familial clustering of hepatocellular carcinoma（HCC） to provide some evidence for the seeking susceptibility gene or resistant gene of HCC in Guangxi Zhuang people，China.Method：Using gender， age 5 year old matching method，from high incidence of hepatocellular carcinoma in Guangxi Zhuang，48 members whose families with two or more than two HCC patients were selected as the experimental group，and 48 members from families without any cancer were selected as the control group.Peripheral blood samples were collected to extract DNA for testing HLA-DQB1 alleles by PCR-SSP.Result：（1）The gene frequencies of alleles HLA-DQB1*02/06/07 in the experimental group and the control group were 8.33% and 33.33% （ 字2=9.095，P=0.003），33.33% and 8.33%（ 字2=9.095，P=0.003），25.00% and 50.00% （ 字2=6.400，P=0.011） respectively；HLA-DQB1*04/05/08/09 were 0 and 8.33%，50.00% and 41.67%，25.00% and 16.67%，8.33% and 8.33% respectively（P>0.05）.（2）The gene frequencies of alleles HLA-DQB1*02/04/05/06/07/08/09 in the HBsAg positive and the HBsAg negative group were 15.79% and 22.08%，0 and 5.19%，42.11% and 46.75%，26.32% and 19.48%，47.37% and 35.06%， 21.05% and 20.78%，5.26% and 9.09% respectively（P>0.05）.（3）There were no significant correlation between LA-DQB1 alleles and sex（P>0.05）.Conclusion：（1）HLA-DQB1*02/07 may to be the antagonist genes of hepatocellular carcinoma of Guangxi Zhuang，and HLA-DQB1*06 may be susceptibility gene for its；（2）HLA-DQB1 allele may have no significant association with hepatitis B virus infection and sex in the high incidence area of Guangxi Zhuang.

【Key words】 HLA-DQB1； Allele； Hepatocellular carcinoma； Familial clustering

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.09.001

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的死亡率在各种恶性肿瘤中位居第三位，我国肝癌患者数量居世界首位，并有继续升高的趋势[1-3]。既往研究发现，广西是我国乙肝病毒型肝炎和肝癌的高发区，并且在肝癌高发区中存在明显的家族聚集现象[4-6]。肝癌的发病机制尚不明确，但近年来的研究表明，原发性肝癌的发病可能与环境因素、遗传因素及免疫功能等有一定的联系[7]。人类白细胞抗原（HLA）作为个体组织细胞的遗传标志之一，在抗原的递呈与识别、调节免疫应答的强弱等方面具有关键性的作用[8]。笔者前期的研究已发现HLA与肝细胞癌的发生、发展密切相关[9-10]。本试验应用PCR-SSP技术检测广西肝癌高发区人群HLA-DQB1等位基因的多态性，为寻找广西壮族人群肝癌的遗传易感基因或拮抗基因提供线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取广西壮族肝癌高发区肝癌高发家族成员48例作为试验组，以相同的生活条件、生活习惯以及生活水平、相同性别、年龄±5岁作为配对条件，选择无癌家族成员48例作为对照组。肝癌高发家族的定义：有血缘关系的家族成员中发生过2例或2例以上的原发性肝癌（HCC）病例；无癌家族定义：有血缘关系的家族成员中未发生过任何恶性肿瘤病例的家族。试验组中，男35例，女13例；平均年龄（28.79±18.01）岁；对照组中，男35例，女13例；平均年龄（30.40±16.99）岁。所有研究对象的HCV抗体均为阴性。所有肝癌病例诊断符合第四届全国肝癌学术会议修订的肝癌标准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与DNA提取 抽取研究对象空腹时外周静脉血10 mL，其中5 mL自凝血用于乙肝两对半（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，阳性者检测乙肝病毒DNA）、丙肝抗体、肝功能等项目的检测。5 mL抗凝血混匀分装后，采用北京艾德莱生物科技有限公司的人基因组DNA试剂盒提取DNA，并保存于-80 ℃待测。

1.2.2 HLA-DQB1基因型的检测 应用天津秀鹏公司HLA-DQ基因分型低分辨检测试剂盒（PCR-SSP法），严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.2.3 PCR反应体系及扩增条件 （1）PCR反应体系的组成：1000 μL dNTP-Buffer工作液的配制：将440 μL浓缩dNTP-Buffer和560 μL无菌水充分混匀；配制Buffer-酶-样本混合液：80 μL dNTP-Buffer工作液、0.7 μL Taq酶、8 μL DNA充分混合，分别向每个引物孔（1～8）各加入10 μL上述混合液。（2）扩增条件：见表1。（3）PCR产物确定：将扩增产物7 μL加到2.5%琼脂糖凝胶孔中，145 V电泳10～15 min，直到内参带和阳性带清晰分开为止。

1.2.4 结果判读 将胶放入凝胶成像系统中观察，结果判读参照试剂盒提供的结果分型表，如只检测出一个等位基因，则视为纯合子。试剂盒可检出的范围：HLA-DQB1*（02～09），其中HLA-DQB1*03归为HLA-DQB1*（07～09），结果见图1。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计分析，HLA-DQB1各基因位点分布用行X列 字2检验进行分析，关联强度用比值比（odds ratio，OR=ad/bc）反映，计算两组各位点基因分布频率，双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组HLA-DQB1各等位基因表达频率的分布及比较 HLA-DQB1*02/06/07等位基因在试验组及对照组的阳性率分别为8.33%和33.33%、33.33%和8.33%、25.00%和50.00%，两组间此3种等位基因比较差异均有统计学意义（P<0.05），HLA-DQB1*02/07等位基因在试验组的表达频率均显著低于对照组，其OR值分别为0.182和0.333，HLA-DQB1*06等位基因在试验组的表达频率显著高于对照组，其OR值为5.500，而HLA-DQB1*04/05/08/09等位基因在两组间的频率分布比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.2 HLA-DQB1各等位基因的表达与性别及HBV感染的相关性 统计结果表明，HLA-DQB1各等位基因与HBV感染、性别均无明显相关（P>0.05），见表3～4。

3 讨论

作为首次发现与疾病有明确关系的人类遗传系统，人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）具有共显性、多态性及多基因性等遗传特征。迄今已有较多的研究表明，HLA Ⅱ类抗原的表达在部分肿瘤中存在异常[11-12]。本研究对HLA-DQB1各等位基因在广西壮族人群肝癌高发家族组及无癌家族组中的表达频率进行结果分析发现，携带HLA-DQB1*02/07等位基因的家族成员发生肝癌的风险明显降低，此两种等位基因可能是肝癌发生的拮抗基因，而HLA-DQB1*06等位基因表达的家族成员比无HLA-DQB1*06等位基因表达的家族成员发生原发性肝癌的几率高5.500倍以上，其可能是肝癌发生的易感基因。HLA-DQB1*04/05/08/09等位基因可能与广西壮族人群肝癌的家庭聚集现象及肝癌的发生发展无明显关联。

在不同国家、不同民族及地区，对HLA复合体与肝细胞癌之间的关联性的研究，结果差异较大。金丹[13]在对大连地区肝癌患者的研究中发现HLA-DQB1*06基因可能是原发性肝癌的拮抗基因，而HLA-DQB1*03可能是易感基因。El-Chennawi等[14]对埃及地区肝癌患者研究表明，DQB1*02在肝癌患者中明显高于正常组，DQB1*06则明显低于正常组，从而推测DQB1*02可能为肝癌的易感基因，而DQB1*06可能为其保护基因。程元桥等[15]对湖北地区汉族人群的研究结果表明DQB1*0501等位基因与湖北地区汉人乙肝后肝硬化相关联，推测其可能是湖北地区汉人乙肝后肝硬化的易感基因，而DQB1*0602则呈负相关，可能为其保护基因，而肝硬化极易导致肝癌的发生。Li等[16]对山西地区人群HLA-DQB1等位基因研究发现HLA-DQB1*0202、*0301等位基因可能是乙肝相关性原发性肝癌及家族性乙肝原发性肝癌的易感基因，HLA-DQB1*0302等位基因可能是家族性乙肝原发性肝癌的拮抗基因。HLA-DQB1*0301等位基因可能与肝细胞HBV-DNA复制有关，从而可能导致肝癌，而HLA-DQB1*0302等位基因可能会抑制HBV-DNA的复制从而减少肝癌的发生。本研究结果发现HLA_DQB1*06等位基因可能是肝癌的易感基因，而HLA-DQB1*02/07等位基因则可能是肝癌的拮抗基因，与上述研究结果存在一定差异，这可能与研究对象的民族和地区分布有关，HLA-DQB1*06等位基因可能是肝癌的易感基因，可能是广西壮族的一个民族特色。并且本试验是以肝癌高发家族及无癌家族成员作为研究对象，均为正常人，而上述研究的试验组都是肝癌患者，对照组为正常人，在研究对象的选择上也与本试验存在差异，这可能也是导致研究结果不同的原因。Chalub等[17]对巴西亚马逊地区肝癌患者HLA-DQB1等位基因研究发现HLA-DQB1*04等位基因可能是HBV感染者发展为肝癌的危险因素。Xin等[18]进行Meta分析证实HLA-DQB1*02（OR=1.78，P=0.03）、HLA-DQB1*03（OR=0.65，P=0.007）、DQB1*0502（OR=1.82，P=0.01）、DQB1*0602（OR=0.58，P=0.03）与肝癌发生的风险显著相关，根据其分析结果表明HLA-DQB1*02、DQB1*0502为HCC的危险因素，而HLA-DQB1*03、DQB1*0602则为其保护因素，本研究结果却发现HLA-DQB1*04/05可能对广西壮族人群肝癌高发区肝癌的发生无明显影响，表明HLA-DQB1*04/05的缺失可能与广西肝癌的遗传易感性无明显相关，其可能只是广西壮族人群的遗传特征之一。

以往的研究发现，广西肝癌高发区的肝癌家族聚集性与HBV感染密切相关[19]。梁军等[20]对新疆维吾尔族HLA-DQB1基因多态性与HBV感染结局相关性的研究中发现，HLA-DQB1*0201可能是该族人群HBV感染的拮抗基因，DQB1*03可能是其易感基因，其中DQB1*0301与HBV的持续感染有关，而携带DQB1*0303的人群更易发展成为ASC，这可能与病毒的清除效率较低有关。本研究中HLA-DQB1各等位基因的表达频率在HBV感染组与非HBV感染组间的比较均无显著性差异（P>0.05），提示广西壮族人群肝癌家族聚集性可能不是由于HLA-DQB1各等位基因造成机体对HBV感染的遗传易感性所致。

本研究还存在一定的局限性，在后续的研究中，可以进一步扩大样本数量，以期望在基因水平上对原发性肝癌的家族聚集性进行更深一步的探讨。

参考文献

[1] Jemal A，Bray，F，Center M M，et al.Global cancer statistics[J].CA：A Cancer Journal for Clinicians，2011，61（2）：69-90.

[2] Ferlay J，Shin H R，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008[J].International Journal of Cancer Journal International Du Cancer，2010，127（12）：2893-2917.

[3]陈万青，郑荣寿，张思维，等.2003～2007年中国癌症发病分析[J].中国肿瘤，2012，21（3）：161-170.

[4]吴继周，钟世聪，刘启福，等.广西肝癌高发区五项危险因素与原发性肝癌关系的定群研究[J].广西医学院学报，1992，9（3）：12-15.

[5]沈立萍，杨进业，莫兆军，等.广西壮族自治区1996～2005年乙型肝炎发病状况监测分析[J].疾病控制杂志，2007，11（2）：210-211.

[6]吴继周，罗光汉，苏明华，等.乙型肝炎病毒与丙型肝炎病毒及其基因亚型的重叠感染与原发性肝癌家庭聚集性的关系[J].中华流行病学杂志，2002，23（6）：488.

[7] Joo J K，Kim S H，Kim H G，et al.CpG methylation of transcription factor 4 in gastric carcinoma[J].Annals of Surgical Oncology，2010，17（12）：3344-3353.

[8] Wong C M，Ng I O.Molecular Pathogenesis of hepatocellular carcinoma[J].Liver Int，2008，28（2）：160-174.

[9]马莎莎，吴继周，吴健林，等.HLA-DRB1*03/04等位基因与广西原发性肝癌家族聚集性的相关性[J].世界华人消化杂志，2013，21（4）：346-351.

[10]吴健林，吴继周，韦颖华，等.HLA-DRB1*07/09/11等位基因对广西肝癌高发区肝癌家族聚集性的影响[J].应用预防医学，2013，19（4）：193-198.

[11]吴静，马燕花.HLA-Ⅱ等位基因多态性及其与食管癌的相关性[J].中国肿瘤临床与康复，2004，11（5）：97-100.

[12]张素芳，史成章.胃癌及癌前病变中树突状细胞浸润、HLA-DR抗原表达的临床意义[J].肿瘤防治研究，2004，31（5）：261-263.

[13]金丹.原发性肝癌的发生与HLA-DRB1、HLA-DQB1基因多态性的关联[D].大连：大连医科大学，2013.

[14] El-Chennawi F A，Auf F A，Metwally S S，et al.HLA-class Ⅱ alleles in Egyptian patients with hepatocellular carcinoma[J].Immunological Investigations，2008，37（7）：661-674.

[15]程元桥，林菊生，梁扩寰，等.DQB1等位基因多态性与乙肝后肝硬化的遗传易感性研究[J].胃肠病学和肝病学杂志，2005，14（3）：235-238.

[16] Li Q，Li X，Zhang L，et al.Correlation between polymorphisms in the human leukocyte antigen-DQB1 alleles and hepatitis B with primary hepatocellular carcinoma[J].Chinese Journal of Hepatology，2015，23（4）：270-274.

[17] Chalub S R，da Silva R M，da Silva A P，et al.Evaluation of a histocompatibility antigen related to hepatitis B virus in patients with hepatocellular carcinoma in the western Brazilian Amazon[J].Genetics and Molecular Research：GMR，2013，12（2）：1336-1346.

[18] Xin Y N，Lin Z H，Jiang X J，et al.Specific HLA-DQB1 alleles associated with risk for development of hepatocellular carcinoma：a meta-analysis[J].World Journal of Gastroenterology：WJG，2011，17（17）：2248-2254.

[19]吴继周，汤春园，蒋杰球，等.HBV感染及复制状态在HCC家庭聚集性中的作用研究[J].广西预防医学，1997，3（5）：10-12.

[20]梁军，张永萍，杨晓筠，等.新疆维吾尔族HLA-DQB1基因多态性与HBV感染结局的相关性[J].安徽医科大学学报，2013，48（5）：530-534.

（收稿日期：2015-12-29） （本文编辑：欧丽）