不同浓度肝素对高糖诱导的人腹膜间皮细胞水通道蛋白的影响

李鸽　肖伟　桂永丰　丁敬韬　任泽银　赵久阳

【摘要】 目的：研究不同浓度梯度的肝素对高糖诱导的人腹膜间皮细胞水通道蛋白AQP1、AQP3蛋白表达的影响。方法：采用免疫组化法检测试验组与对照组AQP1、AQP3蛋白的表达。结果：与对照组比较，试验组AQP1和AQP3蛋白阳性表达均明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05）；且AQP1和AQP3蛋白表达水平在2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素组呈现明显上调，差异均有统计学意义（P<0.05）；免疫组化示2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素组细胞可见胞核及胞浆有空泡样改变。结论：大剂量肝素在高糖环境中可显著诱导AQP1、AQP3的表达，且能使胞浆及胞核出现明显的空泡样改变。

【关键词】 肝素； 人腹膜间皮细胞； 水通道蛋白

The Effect of Different Concentrations of Heparin on the Expression of Aquaporins of Human Peritoneal Mesothelial Cells Induced by Glucose/LI Ge，XIAO Wei，GUI Yong-feng，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（09）：017-021

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of different concentrations of heparin on the expression of aquaporin-1（AQP1） and aquaporin-3（AQP3） of human peritoneal mesothelial cells（HPMCs） induced by glucose.Method：The expression levels of AQP1 and AQP3 were detected by immunohistochemistry in the control group and the experimental group.Result：Compared with the control group，the expression of AQP1 and AQP3 were upregulated in the experimental group treated by 2.5% glucose and 1.5×10-2 mg/mL of heparin，the differences were statistically significant（P<0.05）.Vacuolation was observed in the nucleus and cytoplasm treated by glucose and 1.5×10-2 mg/mL of heparin by immunohistochemistry.Conclusion：The expression of AQP1 and AQP3 can be upregulated by glucose and high concentration of heparin.Vacuolation can be observed in the nucleus and cytoplasm treated by glucose and high concentration of heparin.

【Key words】 Heparin； Human peritoneal mesothelial cells； Aquaporin

First-authors address：The First Peoples Hospital of Changde，Changde 415000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.09.005

腹膜透析是肾脏替代治疗方法之一，相对于血液透析而言，其具有维持血液动力学稳定、保护残余肾功能等优势。长期以来，一直认为腹膜透析中水分子的跨膜转运方式为简单扩散，但Agre等[1]发现了28KD通道构成整合膜蛋白，提出了通道介导的水转运方式。Rippe等[2]用电脑模型，首次对水的跨膜转运用三孔模型进行了解释。超微孔（3-5?）被证实对水分子具有选择通透性，水通道蛋白（aquaporins，AQPs）为超微孔的对应物，可选择性地跨膜转运水分子，某些小分子溶质如甘油、尿素等也可被水通道蛋白转运。水通道蛋白（aquaporin，AQP）广泛存在于动、植物及微生物的细胞膜上，迄今为止，已发现200余种水通道蛋白，在哺乳动物中，已克隆并鉴定出13种水通道蛋白，分为别AQP0～AQP12[3]。在与吸收和分泌液体有关的上皮细胞和协同水跨膜转运的内皮细胞中这些AQPs广泛存在。研究表明，在某些特定条件下，水通道蛋白的表达受到激素、渗透压改变和某些药物的影响[4]。Tang等[5]提出AQP1存在于腹膜间皮细胞上，渗透剂（如葡萄糖）可诱导其转录和表达。Lai等[6]发现AQP3亦存在于腹膜间皮细胞上。临床上腹透管堵塞为腹膜透析患者常见并发症，为预防腹透管堵塞，肝素抗凝经常使用于腹透液中。有研究显示，大剂量肝素添加于含葡萄糖的腹透液中可使腹膜透析的超滤量增加[7]，这是否是通过影响了腹膜间皮细胞中AQP1、AQP3的表达而实现的，未见相关报道。故本实验观察腹膜间皮细胞AQP1、AQP3经高糖诱导后肝素对其表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 （1）主要试剂：AQP1、AQP3一抗，美国Santa Cruz公司产品；细胞消化液（0.125%胰蛋白酶-0.02%EDTA-Na2，Sigma公司产品；1640培养液，Invitrogen公司产品；胎牛血清（FBS），天津TBD公司产品；DAB显色液，北京中杉金桥生物技术有限公司生产；免疫组化SP试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司产品；D-葡萄糖（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；肝素钠注射液（12 500 U/2 mL，12 500 U相当于100 mg），江苏万邦生化医药股份有限公司。PBS液、D-Hanks平衡盐溶液为本实验室自行配置，过滤灭菌分装，室温保存。（2）主要仪器：二氧化碳培养箱，德国贺力式公司；垂直层流洁净工作台，上海上净净化设备有限公司；高速台式冷冻离心机，德国贺力式仪器公司；紫外可见分光光度计（型号UV-9100），北京瑞利分析仪器公司生产；紫外分析仪（型号WFH-201）：温州市孚华分析仪器厂；倒置相差显微镜：日本奥利巴斯公司生产。

1.2 人腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定 本实验从连续性腹膜透析患者透出液中分离并提取人腹膜间皮细胞，无菌条件下收集患者流出液标本，于4 ℃1000 r/min离心10 min，弃除上清。用D-Hanks平衡盐溶液洗涤沉淀2次，将细胞接种于含10%（V/V）胎牛血清的1640培养液的培养瓶中，置于CO2培养箱中37 ℃培养。培养24 h后，光镜下观察贴壁生长情况，待贴壁良好后用新鲜培养液替换旧培养液，此后约每3天换液一次。待细胞生长融合成单层细胞后，用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA 2 mL混合液消化细胞，吸管吹打均匀，使细胞密度保持在（1×105～1×106）/mL。第二代细胞用于形态学及免疫组化鉴定，第三代细胞进行实验研究。免疫组化显示抗细胞角蛋白抗体阳性、抗波形蛋白抗体染色阳性，这正是间皮细胞的免疫学特征。抗第Ⅷ因子抗体和抗白细胞CD45抗体染色阴性，由此可排除血管内皮细胞、成纤维细胞等。

1.3 分组与处理 将培养至第三代的人腹膜间皮细胞均匀接种在6孔培养板上，当细胞贴壁生长达约80%融合状态时，用无血清的1640培养液同步化24 h，使多数细胞处于G0期。用一定剂量的无菌注射用水稀释肝素钠注射液（50 mg/mL），配置不同浓度的肝素溶液；无菌称取葡萄糖25 g，将其溶于无菌三蒸水1000 mL中，配置成2.5%高糖溶液。然后按照不同实验要求随机分为以下五组：（1）无葡萄糖、无肝素对照组；（2）2.5%葡萄糖组；（3）2.5×10-3mg/mL肝素+2.5%葡萄糖组；（4）5.0×10-3 mg/mL肝素+2.5%葡萄糖组；

（5）1.5×10-2 mg/mL肝素+2.5%葡萄糖组。

1.4 免疫细胞化学检测AQP1、AQP3蛋白表达 吸取6孔培养板中的培养液，用pH=7.4的PBS液冲洗3次，再用2%多聚甲醛冰上固定30 min。再用PBS冲洗，5 min/次，冲洗3次。待自然风干后，用3%H2O2室温避光孵育30 min以灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗5 min，洗3次，正常血清封闭非特异性抗原10 min后，加Ⅰ抗AQP1、AQP3多克隆抗体（1∶200稀释），置于4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，5 min/次，加入生物素化Ⅱ抗37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次，加入链酶亲和素-生物素-碱性磷酸酶复合物，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次。在盖玻片上滴加DAB显色液，显微镜下观察10 min，镜下观察至出现棕黄色阳性信号，蒸馏水水洗终止反应。苏木素复染，碳酸锂水溶液（pH7.0～8.0）返蓝；梯度乙醇逐级脱水；透明，过二甲苯溶液；中性树胶封片，自然风干。光镜下观察拍照，每张切片镜下随机取5个视野，用Image Pro Plus6.0图像分析软件测量出积光密度值（IOD），并计算平均光密度。着色越深，则IOD值越大，表明该蛋白表达水平越高，最后对各组的AQP1和AQP3蛋白表达水平进行统计学分析，看是否具有统计学差异。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间的比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫组化结果显示：无糖无肝素组、2.5%葡萄糖组中AQP1、AQP3蛋白均有表达（图1～3），但在2.5%葡萄糖加不同浓度梯度的肝素组中AQP1、AQP3阳性表达均明显高于无糖无肝素对照组，差异均有统计学意义（F=6.82，P<0.05），胞核上亦可见棕黄色深染颗粒；与2.5%葡萄糖组比较，AQP1蛋白在2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素组中的表达明显增加，差异有统计学意义（t=3.92，P<0.05）；以及2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素组与2.5%葡萄糖加2.5×10-3 mg/mL及5.0×10-3 mg/mL肝素组比较，AQP1的表达差异均有统计学意义（t=4.25、4.59，P<0.05）；而2.5%葡萄糖组、2.5%葡萄糖组加2.5×10-3 mg/mL肝素组、2.5%葡萄糖组加5.0×10-3 mg/mL肝素组之间，组间比较差异均无统计学意义（F=2.54，P>0.05），见图4～6、图10。与2.5%葡萄糖组比较，AQP3蛋白在2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素组中表达明显增加，差异有统计学意义（t=4.51，P<0.05）；2.5%葡萄糖加

1.5×10-2 mg/mL肝素组与2.5%葡萄糖加

2.5×10-3 mg/mL、5×10-3 mg/mL肝素组比较，AQP3蛋白表达比较差异均有统计学意义（t=5.04、4.88，P<0.05）；而2.5%葡萄糖组与2.5%葡萄糖加2.5×10-3 mg/mL、5×10-3 mg/mL肝素组比较，AQP3蛋白表达无明显统计学差异（F=1.91，P>0.05），见图7～9、图11。2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素组细胞免疫组化图片可见，胞核及胞浆有空泡样变，而2.5%葡萄糖加常规剂量肝素组胞浆胞核未见明显空泡样变。

3 讨论

自三孔模型的提出以来，水通道蛋白的研究逐渐引起人们的重视，它们对转运细胞内外的水分子有重要作用，某些小分子溶质在特定情况下也可被其跨膜转运。现有的研究提示在人的腹膜间皮细胞中存在AQP1、AQP3蛋白质的表达[8]。AQP1为选择性水通道蛋白，AQP3不仅对水通透，而且能介导甘油或尿素等小分子的通透性。研究证实，AQP3与肾脏尿浓缩能力密切相关，如果AQP3缺失将会导致小鼠多饮多尿及肾萎缩等[9-10]。大鼠腹膜细胞上的AQP1经HgCl2阻断后，66%的水分子转运受到抑制[11]。目前认为在腹膜间皮细胞跨膜水转运中AQP1、AQP3是其主要通道，其蛋白数量、结构或功能的改变，均对腹膜透析的水超滤改变有一定影响。研究表明，高糖腹透液可以促进腹膜间皮细胞AQP1的表达[12]，且能增加AQP1由胞质转移到胞膜上，从而增加该细胞对水的通透性。这种穿梭机制的存在提示AQP1在细胞内分布的改变可能也与腹膜超滤衰竭的发生有关[13]。长期的腹膜透析可引起腹膜组织纤维化，导致超滤衰竭，使患者被迫放弃透析治疗，极大影响肾衰竭患者的生活质量。临床上肝素作为常用抗凝剂，主要用于防止血栓形成或栓塞性疾病、DIC，亦用于血液透析、腹膜透析预防腹透管堵塞等抗凝。研究表明，低分子肝素还能延缓早期肾功能不全进展，且对肾病综合征患者疗效较好[14-15]。但肝素或低分子肝素对经高糖诱导的腹膜间皮细胞AQP1、AQP3的表达是否有影响，国内外相关报道甚少。由此笔者猜想肝素是否通过对高糖环境中腹膜间皮细胞上的水通道蛋白表达的影响来增加超滤及尿素排泄的。

本研究通过人腹膜间皮细胞（HPMCs）的体外培养实验表明，与无糖无肝素对照组比较，2.5%葡萄糖组及不同浓度梯度的试验组中AQP1和AQP3蛋白阳性表达均明显增加，差异均有统计学差异（P<0.05）；且AQP1和AQP3蛋白表达水平在葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素组呈现明显上调，差异有统计学意义（P<0.05）；免疫组化示葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素组细胞可见胞核及胞浆有空泡样改变。本实验主要阐述了肝素对腹膜间皮细胞上AQP表达的影响及1.5×10-2 mg/mL肝素对腹膜透析中腹膜间皮细胞可能存在的损伤作用，这种表现的具体过程及分子机制有待深入研究。笔者进一步推测人腹膜间皮细胞中AQP1、AQP3表达或功能的改变可影响跨腹膜水转运，甚至可导致腹膜超滤衰竭的发生。

总之，本研究证实了在2.5%高糖环境下1.5×10-2 mg/mL大剂量肝素对体外培养的人腹膜间皮细胞上AQP1、AQP3的表达有明显上调作用，并致胞浆胞核出现空泡样改变，而在常规剂量下未见此改变，提示中低剂量的肝素对人腹膜间皮细胞可能具有一定程度的保护作用。

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（收稿日期：2015-10-08） （本文编辑：欧丽）