HE4在子宫内膜异位症中的表达及意义

任俊英 王维琴 王艳婷 皇甫昱

[摘要] 目的 通过检测HE4在异位子宫内膜、正常子宫内膜中的表达，以进一步分析HE4在子宫内膜异位症的发生发展，以及良性疾病恶性表现中所起的作用。方法 选择内蒙古自治区人民医院2012年7月—2014年7月收治的90例，通过病理确诊的子宫内膜异位症60例，正常内膜组织的因子宫病变而进行子宫全切术的患者30例。采用免疫组化实验方法对两组石蜡切片进行化学染色，并进行对染色结果的染色强度进行评价，同时应用mIgae-or-plus对染色切片中的阳性部分测量其平均灰度值（mean IOD），并分析HE4在子宫内膜异位症中的表达情况。结果 ①HE4主要在子宫内膜腺上皮细胞中表达，而间质中仅有少量表达，且腺体中的表达明显高于间质（P=0.000 <0.05）。异位内膜组与正常内膜组比较，腺上皮中的表达异位内膜组高于正常内膜组（χ2=7.200 0，P=0.007 <0.05）。②子宫内膜异位症中异位内膜在r-AFS分期中Ⅰ～Ⅱ期的HE4表达强度低于异位内膜组Ⅲ～Ⅳ期，两者比较有统计学意义（t=11.117，P=0.000 <0.05）。③异位内膜组织在月经周期的增生期HE4阳性表达高于分泌期HE4的表达，差异有统计学意义（t=10.496，P=0.000 <0.05）。正常内膜组织在月经周期的增生期HE4阳性表达高于分泌期HE4的表达，差异有统计学意义（t=7.483，P=0.000 <0.05）。结论 HE4在子宫内膜异位症异位内膜的表达增强，从r-AFS分期，I期至IV期，异位内膜组织中含量呈上升趋势，说明HE4可能参与了子宫内膜异位症的发生和疾病的发展。

[关键词] HE4；子宫内膜异位症；免疫组化

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）03（c）-0033-04

Expression of HE4 in the Endometriosis and Its Significance

REN Jun-ying1， WANG Wei-qin2， WANG Yan-ting1， HUANGFU Yu3

1. Department of Obstetrics and Gynecology， Hohhot First Hospital， Hohhot， Inner Mongolia Autonomous Region， 010030 China；2. Department of Obstetrics and Gynecology， Inner Mongolia Peoples Hospital， Hohhot， Inner Mongolia Autonomous Region， 010010 China；3. Department of Personnel， Hohhot Municipal Health Bureau， Hohhot， Inner Mongolia Autonomous Region， 010010 China

[Abstract] Objective To detect the expression of HE4 in endometriosis and normal endometrium， in order to further explore the generation and development of HE4 in endometriosis and its effect in benign disease with malignant manifestations. Methods In this study， the 90 tissue specimens are from the Department of Pathology， Inner Mongolia Peoples Hospital， from July 2012 to July 2014. Totally 60 endometriosis samples were investigated as the experimental group， and 30 normal endometrium tissue samples from 30 cases underwent hysterectomy due to uterine lesions were set as the negative control group. The expression of HE4 was examined by immunohistochemical staining between experimental group and control group. And the expression intensity of HE4 was estimated by the microscope. The mean IOD of positive expression rates of HE4 was determined by mIgae-or-plus. The expression of HE4 in the endometriosis was analyzed. Results ①HE4 mainly expressed in endometrial glandular epithelial cells， it only expressed a little in mesenchyme. The expression of HE4 in the glandular tissue was much more than that in the mesenchyme（P=0.000）. The expression of HE4 in the glandular epithelium in the ectopic group was higher than that in the normal endometrium group（χ2=7.200 0， P=0.007<0.05）. ② The expression of HE4 in ectopic endometrium r-AFS stage Ⅲ～Ⅳ was higher than that in stageⅠ～Ⅱin endometriosis（t=11.117， P=0.000）. ③ The expression of HE4 in proliferative phase of menstrual cycle was higher than that in secretory phase in the ectopic endometrium（t=10.496， P=0.000<0.05）. The expression of HE4 in proliferative phase of menstrual cycle was higher than that in secretory phase in the normal endometrinm（t=7.483， P=0.000<0.05）. Conclusion The expression of HE4 in ectopic endometrium in endometriosis is significantly higher than that in normal endometrium. With the stage increasing from r-AFS stage I to IV， the expression of HE4 shows a rising trend， which indicates that HE4 may participate in the occurrence and development of endometriosis.

[Key words] HE4； Endometriosis； Immunohistochemistry

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是妇女的常见病、多发病，好发于生育期妇女，该病的发病率近年来逐渐增加。临床表现为下腹痛和痛经、月经异常、不孕等[1]。EMs是一种良性疾病，表现的细胞增生、侵润、复发等恶性生物学行为，以及有组织学恶变倾向，使之成为妇产科医生的困扰。尽管先进的研究日渐深入，但对其确切的发病机制仍然不明，治疗上也就不满意，成为妇产科临床与基础研究的焦点和难点[2]。随着国内外研究者对新发现的人附睾分泌蛋白因子4（human epididymis protein 4，HE4） 的不断深入研究，发现HE4在子宫内膜异位症中也发挥着重要作用[3]。因此，该研究对2012年7月—2014年7月就诊于内蒙古自治区人民医院的90例患者，根据术后病理确诊为异位子宫内膜60例、正常内膜30例进行免疫组化检测HE4的表达结果，进一步探讨HE4与子宫内膜异位症的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象选择内蒙古自治区人民医院90例手术患者的石蜡标本，通过病理确诊其中子宫内膜异位症的石蜡标本60例，患者年龄31～52岁，平均年龄35岁。对60例异位内膜组织蜡块进行r-AFS分期中Ⅰ期8例、Ⅱ期18例、Ⅲ期24例、Ⅳ期10例。正常内膜组织的因子宫病变而进行子宫全切术的患者30例年龄41～56岁，平均年龄46岁。

实验组：异位内膜组织蜡块60例。对照组：正常内膜组织30例。

1.2 试剂及方法

一抗：即用型兔抗人HE4多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，规格100 ug浓缩液。批号14406-1AP；保存开封后4 ℃保存。二抗：即用型SABC免疫组化染色试剂盒规格：12 mL 4℃保存，避免冷冻DAB试剂盒：以上试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司3%过氧化氢：购于福州迈新生物公司自备试剂 购于福州迈新生物公司：免疫组化专用PBS液（pH7.2～7.6）配法：1 000 mL蒸馏水中加氯化钠8.5 g，Na2HPO4 2.8 g，NaH2PO4 0.4 g；0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液：1 000 mL蒸馏水中加枸橼酸三钠（C6H5Na3O4·2H2O）3 g，枸橼酸（C6H8O7·H2O）0.4 g；中性树胶。

1.3 试验方法

免疫组化染色：标本石蜡块，制作成4 μm石蜡切片，烤片，脱蜡，水化，滴加3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）热修复抗原，5%BSA封闭液滴加于每张切片，每张切片滴加第一抗体兔抗人多克隆抗体HE4，4 ℃冰箱过夜，PBS液洗片，每张切片加试剂山羊抗兔IgG，20～37 ℃温箱下卵育20 min，PBS冲洗，每张切片滴加SABC，室温下孵育15 min，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，封片，然后在显微镜下阅片并照相。

1.3.1 观察标准 病理科由2名医生用双盲法分别进行阅片监测。综合染色强度和阳性细胞百分率分布按照SHIMIZU等方法确定HE4在组织中的表达水平。①染色强度，染色不清楚（和）或无染色为0分；染色强于阴性显示为弱黄色为1分；染色清晰棕黄色为2分；染色强为深棕色（和）或褐色为3分。②阳性细胞百分率：阳性细胞数<10%为0分；11%～25%为1分；26%～50%为2分；>50%为3分。每张切片计分等于以上两项分数的乘积；0～1分为（-）；2～3分为弱阳性（+）；4～5分为中度阳性（++）；﹥5分为强阳性（+++）。

1.3.2 平均灰度值测量 mIgae-or-plus5.0专业图像分析系统下，测量每张切片的阳性细胞的平均灰度值（meanIOD）并将数据进行统计学分析。

1.4 统计方法

描述性资料以表示，两独立样本均数比较用t检验；多个样本均数比较，经检验方差不齐，采用多个独立样本比较的秩和检验；异位子宫内膜r-AFS分期Ⅲ～Ⅳ与Ⅰ～Ⅱ期meanIOD值比较，因检验方差不齐，采用两独立样本比较的t检验，检验水准取α=0.05。计数资料组间两两比较采用行×列资料分割的χ2检验，经校正α'=0.008；所得数据均应用SPSS 17.0统计软件进行统计处理分析。

2 结果

2.1 根据测得的平均灰度值分析HE4在子宫异位内膜、正常内膜组织中的表达情况

异位内膜组织中HE4颗粒定位于子宫内膜腺上皮细胞胞膜及细胞浆中呈棕黄色阳性颗粒，部分间质可见阳性表达，其表达的meanIOD值为0.580 1±0.011 5。正常内膜组织中HE4颗粒定位于子宫内膜腺上皮细胞胞膜及细胞浆中呈淡黄色弱阳性颗粒，部分间质可见弱阳性表达，其表达的meanIOD值为0.680 1±0.010 5。

2.2 HE4在子宫内膜间质与腺体中的表达比较

异位子宫内膜腺体与间质不同强度HE4阳性表达的频数分布差异有统计学意义（χ2=15.038，P=0.000﹤0.01）；而正常内膜腺上皮及部分间质也有淡黄色着色（+），腺体及间质HE4阳性表达频数分布差异有统计学意义（χ2=5.455，P=0.000﹤0.05）。见表1。

2.3 异位内膜中不同临床分期HE4的表达

异位内膜组中Ⅰ～Ⅱ期HE4蛋白表达的meanIOD值为0.590 5±0.047；Ⅲ～Ⅳ期HE4蛋白表达的meanIOD值为0.571 9±0.008 2，两者比较，差异有统计学意义（t=11.117，P=0.000<0.05），见表2。

2.4 异位内膜组织中HE4在增生期与分泌期的表达

在异位内膜组增生期与分泌期中HE4表达的meanIOD值分别为0.571 3±0.008 1和0.589 6±0.005 2，差异有统计学意义（t=10.496，P=0.000<0.05）。见表3。

2.5 异位内膜、正常内膜HE4在增生期与分泌期的表达

异位内膜组中增生期与分泌期HE4表达的meanIOD值分别为0.571 3±0.008 1和0.589 6±0.005 2；正常内膜组中增生期与分泌期患者子宫内膜腺体中HE4表达的meanIOD值分别为0.670 5±0.006 9和0.687 6±0.005 7，各组增生期与分泌期meanIOD值两两比较，差异有统计学意义（P =0.000<0.05）。见表4。

3 讨论

子宫内膜异位症是妇女的多发病、常见病，好发于生育期妇女，该病的发病率近年来逐渐增加。其基本病理变化为异位内膜组织病灶随卵巢激素周期性变化发生出血，导致异位子宫内膜纤维组织增生，盆腔粘连，异位囊肿的增大，甚至破裂，并表现出相应的临床症状引起患者不适、疼痛以及不孕，影响生活质量[4]。

该研究通过对异位内膜及正常内膜HE4的表达，发现HE4在异位内膜组织中的表达高于正常内膜，且腺体中的表达高于间质中表达；在子宫内膜的增生期表达高于分泌期的表达；在异位内膜r-AFS分期中高分期的表达要高于低分期的表达。推测HE4可能参与子宫内膜异位症的发病，而且还可能与腺上皮高分泌有关。子宫内膜异位症患者HE4表达水平的上调随子宫内膜异位疾病r-AFS分期的进展程度而升高，病情程度越严重，其HE4的表达越高，在r-AFS高分期的子宫内膜异位症中，由于HE4表达水平上调，使HE4发挥更强的作用及功能[4]，促使异位的子宫内膜细胞更为广泛地种植、侵袭及生长，促进EMs的发生发展。异位内膜组与正常内膜组中HE4的表达，增生期均高于分泌期，提示增生期的子宫内膜的侵袭及迁移的能力高于分泌期。HE4可能在子宫内膜异位症的发病及疾病的异地粘附、侵袭、生长中发挥着重要作用[8]。近年来国内外研究发现，经输卵管逆流入盆腔或经侵入到子宫肌层的子宫内膜碎片中，必须有活的子宫内膜腺上皮和间质细胞，方可能发生移位生长、种植、并引起病变和相应的症状[5-7]。

综上所述，此次研究标本来源于内蒙古自治区近2年的生育期妇女子宫内膜异位症HE4的表达情况。还有待于进一步的扩大研究范围，增加样本量分析HE4在子宫内膜异位症具体的发病机制，提出更为有力的证据。 同时，在肿瘤靶向治疗[9-10]快速发展的今天，也可能为子宫内膜异位症的靶向治疗提供了一个新的思路。

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