微量血凝及血凝抑制试验在实际操作中关键点解析

张　瑜 张庆霞/北京信得威特科技有限公司吴娟/北京市通州区农业局



微量血凝及血凝抑制试验在实际操作中关键点解析

张瑜 张庆霞/北京信得威特科技有限公司
吴娟/北京市通州区农业局

在兽医免疫学实验中，血凝试验（HA）主要用来测定抗原的血凝价以及是否存在血凝性抗原，血凝抑制试验（HI）则作为一种抗体监测技术，广泛应用于兽医实验室监测、兽医门诊、大中型养禽场。在实际应用中，HA和HI试验可用于病毒分离、鉴定、分型，检测抗原抗体、免疫鉴定等等，例如：养禽场常常将禽流感、新城疫、减蛋综合症等疫苗免疫后的抗体水平，作为衡量免疫程序是否合理的依据。尽管此法操作简便、快速、准确、实用，但在实践中也常常由于某些因素的影响，从而使试验结果不精确，有时甚至无法判定结果。本文主要对HA和HI在实际操作中的关键点进行阐述。

一、材料的准备及仪器校准

HA和HI试验中用到的枪头、EP管、采血管、PBS必须全部高压灭菌。注射器必须是新开封，PBS必须在高压之前标定PH=7.2，单枪、排枪必须校准，确定刻度准确。可重复使用的聚苯乙烯有机玻璃板购买时要注意底角是否为90度，底面是否光滑，清洁，如果不清洁，清洗后可用棉签蘸酒精把孔底擦干净。有机玻璃血凝板的好处是可以叠放，在做大批量检测实验时节省空间。如使用一次性凝集板，要求试验前检查凝集板，剔除有漏洞、形状不规则、板面有褶皱、有接口、板面和板孔不干净、不光滑的凝集板。

微量移液器型号的选择、吸嘴的安装不当以及取样时吸嘴外壁是否粘有液体，都会造成移液不准，最终影响试验结果。微量震荡器使用时应注意震动不宜过大，时间不能太长，一般震动10秒钟即可。多块板同时振动时要注意压住上板，以防液体溅出而影响结果。

图1　所需材料及仪器

二、缓冲体系的配置

所用pH7.2、0.01 mol/L PBS缓冲液尽量现用现配，以免因PBS缓冲液配制时间过长、pH值发生变化，使检测结果不准确。一般情况下PBS配好后不需调节PH值，配好后高压灭菌，冷藏保存备用。若需要调则用1N 的NaOH调pH到7.2。PBS一经使用，于2℃～8℃保存不超过3周。如果用灭菌生理盐水代替PBS缓冲液，要求使用前检查生理盐水有无沉淀、异物，并要求将生理盐水pH调制到7.2。

三、鸡红细胞的采取和1％悬液的配置

由于不同个体鸡只红细胞对病毒的敏感性不同从而影响HI效价，所以一般需要采取3只以上公鸡红细胞混合一起用，最好用非免疫公鸡，如果用免疫公鸡代替，须增加洗涤次数和时间。为了保证红细胞的稳定性，在红细胞悬液的制备过程中需掌握好离心速度与时间。红细胞采集应注意防止污染, 洗涤时要尽量抽净白细胞膜,配制的红细胞浓度要准确。进行红细胞悬液配制吸取沉淀的红细胞时，要在试管最底部吸取进行稀释配制，如随意从沉淀的红细胞上层吸取将会导致配制的红细胞悬液浓度偏低，因为最后一次离心洗涤红细胞后弃去的PBS液会有一些残留在沉淀的红细胞上层。配制过程应该加快速度，避免室温操作过长影响红细胞质量。

配好的红细胞悬液4℃保存备用，一般能保存1周，所以每次要根据实际需要来酌情配制，避免不必要的浪费，切忌使用已出现溶血的红细胞进行试验。红细胞悬液要用多少取多少, 使用前一定要摇匀, 保证每一孔中加入的浓度准确一致。

四、四单位抗原的制备

四单位抗原是血凝试验很重要的关键因素，4单位抗原和1 ％红细胞会因自身效价降低和溶血而影响实验结果。因此，每次实验前要根据待测样品数量计算一下本次实验需要多少的4单位抗原和1 ％红细胞，适当配置，避免因多配而引起浪费。试验所用抗原应是稳定性好、效价高的浓缩抗原。抗原在使用前需作血凝(HA)试验，根据该抗原的血凝价配制4HAU抗原。每次HI试验所用4HAU抗原均要现配现用，配好后还应作4HAU抗原校对试验，以确定抗原配制是否准确。配制出准确的4HAU抗原是血凝抑制试验成功的首要条件，既不能低也不能高，同一批样品必须使用同一批4单位，同一批红细胞，决不能补充。另外，4单位抗原不要反复冻融，也不应该存放时间太长，这样都会影响抗原质量。

检验4单位血凝价是否准确，应将配制好的抗原稀释液分别以1 ml的量加入生理盐水1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml和6 ml中，使最终稀释度为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7，然后，从每个稀释度取液体0.25 ml，加入1％鸡红细胞悬液0.25 ml，再加入生理盐水0.25 ml，混匀。将血凝板在室温下放置20～40 min后，如果配制的抗原液为4HA，则1∶4稀释度为凝集终点；如果4HA高于4个单位，可能1∶5或1∶6为终点；如果较低，可能1∶2或1∶3为终点。应根据检验结果作适当调整，使工作液确为4HA。如图2 所示，C即为合适的4HA，A、B低于4个单位，而D和E高于4个单位。

五、待检样品

血样采集后要及时分离血清，分离后及时测定或放置在4℃冰箱内保存，受检血清应无溶血、无污染,要力求新鲜，如暂时不测定可冷冻保存。血清使用前要充分摇匀。待检血清要避免反复冻融，最好4℃保存，3天内完成检测。血清样品如果有溶血、胶冻样现象等应该弃去，动物血清中经常存在非特异性血凝抑制物质，这种抑制物质的浓度可能很高，容易造成假阳性反应，尤其是水禽鸭、鹅的血清，一般应该放置56℃灭活30 min，红细胞吸附或用胰酶处理等方法解决。如要通过鸡蛋来测抗体，卵黄用氯仿抽提后结果更为准确，卵黄加氯仿（卵黄液∶PBS∶氯仿＝1∶1∶2）后混匀室温放置30 min，3 000 r/min，离心5 min，取上清检测。卵黄较血清HI 低1～2个滴度。对于样品数量，中小型鸡场0.1％，大型鸡场不能少于30份，制备好的血清于4℃冷藏尽快送到实验室完成检测。

A：2倍单位；B：3倍单位；C：4倍单位；D：5倍单位；E：6倍单位；F：无抗原对照。图2　校验4单位抗原图示

六、环境温度与时间

因为每个试验室的环境温度各不相同，对于南方北方、有空调和无空调的室温、冬天夏天室温等等的湿度温度均不一样，一般情况下，室温和等待时间成反比关系。不能简单的按照书上说的30min后判定，而应该按照你的阴性和阳性对照的最佳沉淀和凝集时间来判定。因为阴性对照会沉淀，阳性对照会凝集，这个时间是可以随加样的准确性和环境的温湿度而变化的，所以红细胞加入后判定结果的时间就是你的阴阳性对照成立的那一刻，即为试验结果出现的时刻。

在环境温度20℃～25℃，经过20℃ 30分钟即可读出抗原效价和血清抗体滴度。当温度过低，如低于15℃时，出现结果就要慢，往往需要超过40分钟才能出现清晰的结果。因此，为了在较短的时间内出现结果，应将试验中的环境温度控制在20℃～25℃，冬、春季可放入相应温度的恒温培养箱进行反应。试验过程中的环境温度超过30℃时，试验结果出现的要快。往往在15分钟左右就可读数。一旦时间过长，结果就会消失，使整板无凝集现象，给人一种误以为效价为0，或抗体滴度为12 log2。故要求试验环境温度不得超过30℃，反应20～30分钟及时读数，不可长时间拖延读数时间。另外，抗原与抗体作用时间过长或过短对结果影响较大：过短出现凝集不完全；过长出现洗脱现象。

七、结果的判定

判断结果时，将微量血凝板倾斜45度，孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪滴状流淌。不流淌均为凝集颗粒的为凝集孔，完全血凝的抗原或病毒最高稀释倍数为凝集价；边缘无凝集颗粒的为凝集抑制孔，红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度为待检样品的凝集抑制价。

试验中一定要做好对照，结果的判定要严格按照对照孔的情况进行，判定界限以100％凝集为标准，HA试验中，以100％凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝价；HI试验中，以100％抑制病毒凝集的血清最大稀释度为该血清的抗体滴度，读数过程中不能震荡摇晃血凝板，以免影响结果。

总之，在进行微量血凝和血凝抑制试验中，一定要细致耐心，严格按程序操作，排除各种干扰因素，发现问题及时纠正处理，以免类似错误再次出现，这样才会获得满意的实验结果以正确评价疫苗免疫的效果及辅助诊断病毒性疾病。