针刺联合艾灸治疗类风湿性关节炎及血管新生调控因子的作用研究

申 博，陈 迪，林子昊，徐 超，刘竹青

（安徽中医药大学针灸骨伤临床学院，安徽合肥230038）

针刺联合艾灸治疗类风湿性关节炎及血管新生调控因子的作用研究

申 博，陈 迪，林子昊，徐 超，刘竹青

（安徽中医药大学针灸骨伤临床学院，安徽合肥230038）

目的：探讨针刺联合艾灸治疗对类风湿性关节炎（RA）模型鼠趾围及滑膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：采取风、寒、湿环境因素与生物因子（弗氏完全佐剂）联合制作RA大鼠模型，测量治疗前后各组大鼠趾围，免疫组织化学检测大鼠关节滑膜组织中VEGF表达情况。结果：造模后大鼠踝部和足趾出现明显的炎症红肿。治疗后，与模型组比较，艾灸组、针刺组、联合治疗组大鼠趾围降低；联合治疗组大鼠足趾趾围较针刺组、艾灸组降低（P＜0.01）；艾灸组、针刺组、联合治疗组大鼠关节滑膜组织中VEGF表达较模型组显著减少（P＜0.01），联合治疗组滑膜中VEGF表达较艾灸组、针刺组减少（P＜0.01）。结论：针刺联合艾灸可以通过抑制血管内皮生长新生因子改善大鼠RA病情，且效果优于单纯针刺、艾灸治疗。

类风湿性关节炎；针刺；艾灸；血管内皮生长因子

类风湿性关节炎（RA）是一种病因未明、以慢性滑膜炎性增生并形成血管翳为特征的全身性免疫系统疾病，中医称为“历节风”“骨骱痹”等，其典型症状为对称性、周围性多个关节慢性炎性病变，临床多表现为受累关节疼痛、肿胀、功能下降，病变呈持续、反复发作过程。其致畸和致残率较高，是临床常见的疑难病之一。RA女性和男性发病率之比为2∶1～3∶1。据估计我国RA的患病率为0.2%～0.5%［1］，其患病率随年龄增长，成年RA患者约300万，其中老年RA患者约24万［2-3］。

针刺能显著改善类风湿性关节炎的症状，明显提高患者的生存质量，具有疗效稳定、副作用小的优点，大量临床报道充分证实了针刺治疗RA的独特疗效。艾灸治疗RA能显著减少活动期RA患者关节疼痛感及其并发症，临床疗效确切。前期我们通过检索文献发现，针刺联合艾灸治疗RA效果优于单纯使用针刺或艾灸治疗。以往针灸治疗RA的作用机制多从调节免疫功能、改善血液流变学和微循环、对皮质醇分泌的影响以及镇痛作用等方面入手。目前针对血管内皮生长因子（VEGF）的治疗成为RA治疗的一种新的发展方向［4］。但针灸治疗RA对于VEGF因子的影响未见报道。本文探讨针刺联合艾灸治疗RA对于VEGF的抑制作用，为临床治疗RA提供一个新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠50只，月龄3～4个月，体质量（200±20）g，清洁级，由安徽医科大学实验中心提供，许可证号：SCXK（皖）2013-0005。

1.1.2 实验药物 弗氏完全佐剂（FCA 10mL）美国Sigma公司生产，0.25 mm×25 mm无菌针灸针，特制香烟型纯艾条（直径1 cm）。

1.1.3 试剂与仪器 酶标仪（ELX800uv，Bio-TEK公司），MA110型电子分析天平（上海第二天平仪器厂），自制玻璃造模水箱（1.2m×1.0 cm×0.8 cm）。辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗，免疫组化染色试剂盒，DAB（3-3′-四盐酸二氨基联苯胺）显色剂，Rabbit Anti-VEGF一抗。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠RA模型的建立 SD雄性大鼠50只，适应性喂养1 w后，随机抽取10只为正常组，置于室温18℃～20℃动物房内常规喂养，其余大鼠造模。将造模所用大鼠放置在自制玻璃造模水箱内，水面没过大鼠后肢膝关节，湿度控制在80%～90%，温度（5±2）℃，电风扇选择较高风力。将所有造模大鼠放入上述风、寒、湿环境中（12 h/d，8∶00～20∶00）。20 d后于大鼠右侧后肢足趾部注射弗氏完全佐剂0.15 mL/只致炎。观察3 d，大鼠出现肢体明显对称性肿胀或耳部和尾部有炎性结节出现，表示造模成功。造模成功后，将大鼠随机分为模型组、针刺组、艾灸组、针刺联合艾灸治疗组（联合治疗组），每组10只。各组均在相同的条件下饲养。模型组不做任何处理，针刺组、艾灸组、联合治疗组给予相应治疗。

1.2.2 检测指标 ①测量大鼠趾围。②大鼠内固定处死，取关节滑膜组织，部分切片，作免疫组化染色，在光镜下观察HE染色切片组织结构变化。③大鼠内固定处死，取关节滑膜组织，部分制备匀浆液，按照试剂盒说明书检测VEGF的含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠趾围比较

造模前，各组大鼠右后肢足趾趾围比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。注射弗氏完全佐剂3 d后，除正常组外，其余各组大鼠踝部和足趾出现明显的红肿，大鼠右后肢足趾趾围明显增加，表明造模成功。经过15 d治疗后，艾灸组、针刺组、联合治疗组大鼠右后肢由炎症引起的肿胀度较模型组有所减轻（P＜0.01），联合治疗组大鼠的足趾趾围较针刺组、艾灸组减小（P＜0.01）。结果见表1。

表1 治疗前后大鼠足趾趾围比较 （cm，±s）

表1 治疗前后大鼠足趾趾围比较 （cm，±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.01；与联合治疗组比较，2）P＜0.01

组别 n 造模前 造模后 治疗后正常组 10 3.0±0.1 3.0±0.1 3.0±0.1模型组 10 3.0±0.2 4.1±0.21） 3.8±0.2针刺组 10 3.0±0.1 4.1±0.2 3.6±0.21）2）艾灸组 10 3.0±0.1 4.1±0.1 3.5±0.11）2）联合治疗组 10 3.0±0.2 4.1±0.1 3.4±0.21）

2.2 各组大鼠滑膜组织中VEGF表达比较结果见表2。

表2 各组大鼠滑膜组织中VEGF的表达 （±s）

表2 各组大鼠滑膜组织中VEGF的表达 （±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.01；与联合治疗组比较，2）P＜0.01

组别 n 总面积（像素单位）正常组 10 3 000.86±268.271）模型组 10 22 897.12±1123.68针刺组 10 10 667.23±448.251）2）艾灸组 10 9 887.64±609.371）2）联合治疗组 10 6 889.75±378.281）

由表2可见，模型组大鼠关节滑膜组织中VEGF表达较正常组显著增多（P＜0.01）；艾灸组、针刺组、联合治疗组大鼠关节滑膜组织中VEGF表达较模型组显著减少（P＜0.01），联合治疗组滑膜组织中VEGF表达较艾灸组、针刺组减少（P＜0.01）。表明艾灸、针刺、针刺联合艾灸治疗均可使RA大鼠滑膜组织中的VEGF表达明显减少，且联合治疗效果优于单纯针刺、艾灸治疗。

3 讨 论

针刺治疗RA，刺激腧穴通过经络的传输传导作用，激发经气调整脏腑气血的功能，调动人体内在的抗病能力，从而达到扶正祛邪、防治疾病的作用［5］。《灵枢·经脉》：“经脉者，所以决死生，处百病，调虚实，不可不通。”艾灸在中国已有几千年的历史，具有温经通络、祛寒止痛、消瘀散结等作用。大量临床及实验研究发现灸法对机体免疫功能、血液循环、神经内分泌等各个系统都有促进和调整作用。临床研究发现艾灸“足三里”“肾俞”“阿是穴”后关节疼痛、肿胀、晨僵、压痛等临床症状、体征及实验室指标均得到改善［6］。大量实验研究证明，艾灸“足三里”“肾俞”“阿是穴”能显著改善RA大鼠的局部和全身症状［7-8］。

3.1 RA与血管新生的关系

血管新生是在机体生长发育过程中或创伤修复、缺血缺氧和炎症等情况下，原有微血管内皮细胞经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等形成新毛细血管的过程。RA是一种病因未明的以慢性滑膜炎性增生并形成血管翳为特征的全身性免疫系统疾病，RA形态学的主要表现为滑膜增生，在滑膜增生的过程中，早期会存在着新生血管成分。RA发展过程中，一个重要的病理改变就是血管翳的形成，新生血管生成是产生和维持血管翳的重要标志。在增生的滑膜中局部促血管生成因子的异常表达导致血管生成过度活跃，增生的血管进而形成特征性的血管翳［9］。RA的病程发展与局部血管新生关系密切，多种因子参与并调控了这一过程。RA局部炎症及血管新生与滑膜病变进展关系密切，这提示我们，抑制血管新生可能有助于减轻关节炎症状。

3.2 VEGF与RA的关系

VEGF可直接作用于内皮细胞，促进内皮细胞分化、增殖，在体内还可诱导血管发生，增加血管通透性。RA患者关节滑膜组织中新生血管形成，可为滑膜增生带来充足的血流和营养，同时也是炎细胞浸润、炎症介质产生和释放的基础，为形成类肿瘤样的具有侵蚀性生长的RA滑膜组织提供了条件。VEGF通过调节内皮细胞生长、新生血管形成和炎性细胞的趋化性，在RA滑膜血管新生和炎症反应等病理过程中具有至关重要的作用［10］。程琦等［11］研究结果显示RA病情稳定期关节滑膜组织中VEGF蛋白阳性表达明显低于活动期，提示可以VEGF为靶点治疗RA。如通过抑制VEGF基因或蛋白的表达，或采用VEGF抗体、可溶性VEGF受体干扰VEGF与其受体结合后的信号转导，进而抑制滑膜血管增生及血管翳形成，降低血管通透性、减少血浆蛋白外渗，达到缓解滑膜炎症、减轻关节肿胀、延缓关节骨破坏的目的。在抑制血管新生时，RA血管内皮细胞生长因子表达明显降低，且滑膜炎症状明显减轻。

3.3 针刺与血管新生的关系

血管新生是一个复杂的促进和抑制血管新生因子的严格调控的生理和病理过程。VEGF是特异性的内皮细胞有丝分裂剂，通过其受体特异性作用于血管内皮细胞，可以促进血管内皮的增生，从而促进新生血管的形成［12-13］。RA患者滑膜组织VEGF过度增高，诱导关节局部血管组织新生微血管豁形成、关节滑膜组织异常增生、滑膜肿胀充血、关节蜕变等。针刺在发挥血管新生方面起着多环节、多水平、多层次、多途径的调节作用。郭丽红等［14］研究发现电针可以显著改善RA大鼠的饮食状况，增加体质量，减轻关节肿胀，并且能减少VEGF的分泌。说明针刺对VEGF有一定的抑制作用。因此，笔者猜想针刺治疗RA可能是通过抑制VEGF而发挥治疗作用的。

3.4 艾灸抑制血管新生因子治疗RA的理论依据

罗磊等［7］研究发现艾灸能显著改善RA模型大鼠局部和全身症状，减轻关节肿胀，提高大鼠进食、进水量，并能有效调节大鼠血清中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF）的含量，改善神经免疫调节机制，纠正炎症时自由基代谢紊乱，诱导滑膜炎症细胞凋亡，改善局部关节滑膜细胞的超微结构，并证实艾灸对局部关节组织中细胞因子的调节是其抗炎免疫机制之一。提示我们艾灸可以抑制细胞因子的促炎效应，增强细胞因子的抗炎效应，从而抑制血管新生。

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［5］朱世杰，祝骥.针灸治疗类风湿性关节炎研究分析及进展［J］.中国伤残医学，2014，22（2）：304-306.

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（编辑：梁葆朱）

Effectof acupuncture andmoxibustion on the expression of vascular endothelialgrow th factor in RA ratmodels

Shen Bo，Chen Di，Lin Zihao，Xu Chao，Liu Zhuqing
（AnhuiUniversity of Chinese Medicine，Hefei Anhui230038）

Objective：To investigate the effect of acupuncture and moxibustion on the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）in the toe of ratmodel of rheumatoid arthritis（RA）.Methods：Rheumatoid arthritis（RA）ratmodel wasmade by using the wind，cold，wet environmental factors and biological factors（Freund's complete adjuvant）.Rat toe girth wasmeasured and the rat synovial tissue VEGF expression was detected by immunohistochemicalmethod.Results：Rats ankle and toes appearred obvious inflammatory swelling after model establishment.After treatment，compared with model group，moxibustion group，acupuncture group and combined treatment group rats toe girth were decreased and VEGF expression of rat synovial tissuewere decreased significantly（P＜0.01）.Compared withmoxibustion group and acupuncture group，VEGF expression of rat synovial tissue in combined treatment group was decreased（P＜0.01）.Conclusion：Acupuncture combined withmoxibustion can improve the condition of rheumatoid arthritis in rats by inhibiting the growth of vascular endothelial growth factor，and the effect is superior to thatof simple acupuncture andmoxibustion.

rheumatoid arthritis；acupuncture；moxibustion；VEGF

R285.5

A

1671-0258（2016）01-0025-03

2014年安徽中医药大学大学生创新创业项目（2014043）

申博，本科，E-mail：624441574@qq.com

刘竹青，E-mail：ahaqliuzhuqing@126.com